分子大小差异分离纯化方法

（一）透　析

透析是利用蛋白质分子比较大，不能穿过半透膜的性质设计的。半透膜具有不同的膜孔，对通过的分子大小有一定选择性。半透膜一般采用赛璐珞和赛璐酚等材料做成的透析袋，透析袋使用前要处理，以消除附着的重金属蛋白水解酶和核酸酶。处理时，将透析袋放入0.5mol/L的EDTA溶液中煮0.5小时弃去溶液，换上水，再煮几次，储存在含0.01%的NaN3的水中（水温4℃）。使用时，实验者只能用镊子或戴手套操作。

在透析过程中，大分子的蛋白质不能通过半透膜而滞留在透析袋内。小分子的物质可以自由进出透析袋，直到它在透析袋内外的浓度相同，即达到平衡。此时，需更换透析液再透析，如此反复多次，以使小分子物质较完全被去除。透析过程中可测定透析外液中某种小分子物质的浓度，以检查透析结果。采用硫酸铵分步沉淀蛋白后，需用透析法除去蛋白液中的硫酸铵，此时可用氯化钡（BaCl2）溶液检查透析外液，若透析较完全，则加入BaCl2，溶液后无任何变化，否则会有白色沉淀产生。

为保持蛋白质在透析过程中的稳定性，透析液不选用水而选用一定pH的缓冲液，温度则保持在4℃。透析过程是个较慢的扩散过程，所以比较耗时，至少要10个小时，甚至几天。为缩短透析时间，透析液要不断地搅拌并且勤换。

（二）超过滤

超过滤亦称微过滤，其原理是利用压力使样品溶液通过半透膜，滤过水和其他小分子溶质，使大分子的蛋白质等留在膜内，从而达到浓缩蛋白质的目的。(www.xing528.com)

（三）离心分离

该技术根据物质不同的分子、大小形状和质量，在离心场中表现出不同的行为而达到相互分离的目的。利用离心机分离物质主要采用两种方式：一是沉降速度法；二是沉降平衡法。

沉降速度法主要用于分离沉降系数不同的物质，这种方法采用差速离心，即逐步分级加大离心力。开始在一个较低的速度下离心，使其沉降系数大的物质沉淀，其他物质仍保留在溶液中。取上清在更大的离心场中再离心，又会获得一些沉淀物质，如此反复多次，便可使混合物逐级被分开。

沉降平衡法用于分离密度不同的物质。首先，在离心管中造成一个密度环境（单一密度连续密度或梯度密度），使介质的最大密度大于分离物的最大密度。而后加入待分离物，在离心力的作用下，当分离物的密度与介质密度相等时，分离物即停留在与其密度相同的区域，从而达到分离目的。为了便于分离物完全达到它们的平衡常数，要求离心的时间足够长。常用于形成密度的物质有氯化铯、蔗糖和甘油等。