电离性质不同的分离方法-生命科学基础研究入门

（一）电泳法

不同蛋白质之间的分子量不同，在同一pH条件下带电荷的数量不同，在电场中的迁移率就不同，在相同时间内移动的距离也不同。电泳法就是据此把不同的蛋白质区分开。常用的蛋白质电泳有PAGE、SDS PAGE、等电聚焦电泳、双向凝胶电泳及毛细管电泳等。

（二）影响蛋白质电泳迁移率的因素

（1）缓冲液

缓冲液应选用使分离的蛋白质稳定，而且不与其发生反应的体系。缓冲液的pH直接影响蛋白质分子的解离和带电性质及状态，因而会影响迁移率和分离效果。缓冲液的离子强度，一般以0.05～0.1mol/L浓度为宜。离子强度低，产热少，电泳快，区带明显扩散；离子强度高，区带尖锐，泳动距离短，产热多。

（2）电场

电场中因施加的端电压不同，分为常压和高压电泳。常压电泳般在500V以下，电势梯度约10-20V/cm。高压电泳一般在500V以上，电势梯度的为20～200V/cm。高压电泳会产生大量热，所以，高压电泳仪有配套的冷却装置和安全防护装置。

（3）支持介质

支持介质解决了样品扩散问题。支持介质的种类很多，对电泳行为的影响各异。一般选用惰性材料，并不影响蛋白质在电场中的迁移率。但有的支持介质仍对样品有吸附和滞留作用，如纸电泳，这会造成分离物的拖尾现象，影响分辨率。

有的支持介质具有电渗作用。所谓电渗，即一种液体相对于带电的支持物的移动现象。影响较大的有纸电泳、淀粉胶电泳和毛细管电泳等。有的支持介质具有分子筛作用，如淀粉胶、琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺凝胶。可根据待分离蛋白质的分子大小，采用不同的交联度以形成孔径不同的凝胶而将待检测蛋白质分离。粒子在这种凝胶中电泳时，迁移率不仅与其带电性质有关，而且和它们的分子大小有关。分子大的粒子在移动时，受到的阻力大，迁移速度慢。

（三）电泳的类型(www.xing528.com)

（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）具有较高的分辨力和灵活性，因而被广泛应用于蛋白质的分离和分析。然而，凝胶电泳目前仍是一项手工操作较多的技术。操作者如能对电泳原理、凝胶过程以及影响电泳的一些因素多加了解，将有助于顺利完成有关实验，获得分离效果和重复性好的电泳结果。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）经共聚合形成。

（2）蛋白质等电聚焦

蛋白质等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）技术在20世纪60年代后才得到迅速发展和推广应用，现在它是被广泛采用的蛋白质分析和制备技术。与常规电泳不同之处是，在IEF时，蛋白质分子是在含有载体两性电解质形成的连线而稳定的线性pH梯度中进行电泳。通常使用的载体是两性电解质，即脂肪族多氨基多羧酸（或磺酸型，或羧酸磺酸混合型），其在电泳中形成的pH范围有3～10、4～6、5～7、6～8、7～9和8～10等可应用于大多数蛋白质等电点（pI）的范围。IEF电泳时，形成正极为酸性、负极为碱性的pH梯度。当将某种蛋白质（或多种蛋白质）样品置于负极端时，因pH>pI，蛋白质分子带负电，电泳时向正极移动；在移动过程中，由于pH逐渐下降，蛋白质分子所带的负电荷量逐渐减少，蛋白质分子移动速度也随之变慢；当移动到pH=pI时，蛋白质所带的净电荷为零，蛋白质即停止移动。当蛋白质样品置于阳极端时，也会得到同样的结果。因此，在进行LEF时可以将样品置于任何位置。多种不同氨基酸的蛋白质在IEF电泳结束后，会分别聚集于相应的等电点位置，形成很窄的区带。IEF不仅能获得不同种类蛋白质的分离和纯化效果，同时也能得到蛋白质的浓缩效果。

（3）双相凝胶电泳

1975年，O'Farrell首先建立了等电聚焦/SDS聚丙烯酰胺双相凝胶电泳（IEF/SDSPAGE）分离和分析生物大分子蛋白组分的技术。双相凝胶电泳的分离系统充分应用了蛋白质的两个特征和不同的分离原理。第一相是根据不同蛋白质带电荷量的特性，用等电点（pI）聚焦技术分离蛋白质；第二相是根据不同蛋白质分子质量大小的特性，通过蛋白质与SDS形成复合物后，在聚丙烯酰胺凝胶电泳时按分子大小以达到分离蛋白质的目的。SDS是一种阴离子去垢剂，它能破坏蛋白质分子间的共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象。特别是在强还原剂巯基乙醇存在的情况下，由于蛋白质分子内的二硫键已被还原，打开不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS的充分结合，从而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。

已有实验证明，当SDS单体浓度大于1mmol/L时，对于多数蛋白质来说，平均每克蛋白质可结合1.4gSDS。蛋白质分子与SDS结合的复合物，所带的SDS负电荷大大超过了蛋白质分子原有带电量，因而也就掩盖了不同种类蛋白质分子之间原有的电荷差异。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它在水溶液中的形状类似于椭圆棒。不同蛋白质-SDS复合物，其随圆棒的短轴长度是恒定的，约为18？；而长轴的长度则与蛋白质的分子质量大小成比例变化。蛋白质-SDS复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率便不再受蛋白质原有电荷和形状等因素的影响，而主要取决于椭圆棒长度即分子质量大小这一因素。因此，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是进行不同蛋白质组分的分离和蛋白质分子质量测定的可靠技术。

（4）毛细管电泳

所谓毛细管电泳是在内径为25～100μm的石英毛细管中进行电泳。毛细管中填充了缓冲液或凝胶。与平板凝胶电泳相比，毛细管电泳可以减少焦耳热的产生。这主要是由于毛细管内径细，表面积与体积比大，易于扩散热量。另外，电泳时电阻相对大，即使选用较高电压（可高至30kV）仍可维持较小的电流。毛细管电泳通常在高电场下进行，可以缩短分析时间并且提高分辨率。