实验一 大肠杆菌全菌体蛋白样品的制备
【实验原理】冻融法破碎细菌时依赖于悬液的密度和冷冻的速度，由于效率低而很少被采用。玻璃珠法破碎更适合于提取周质蛋白。彻底的破碎通常需要采用超声波破碎或压力破碎的方法，有时还需要加一些溶菌酶。
【实验步骤】
（1）取100mL菌液，5000g离心10min，弃上清。
（2）低盐清洗缓冲液（3mmol/L KCl，1.5mmol/L KH2PO4，68mmol/L NaCl，9mmol/L NaH2PO4）洗菌体3次，每次20mL。离心条件同上，最后残余的液体应尽量用枪头（或者干净的滤纸条）吸尽。
（3）用1.5mL纯水重悬菌体并转入10mL烧杯中。加入2.1g尿素、0.2g CHAPS、0.762g硫脲和38.5mg DTT（终浓度分别为7mol/L、4%、2mol/L和50mmol/L），加入全效蛋白酶抑制剂1片，轻轻吹打使之完全溶解后定容至终体积为5mL。
（4）冰浴超声5min至液体澄清（超声仪SONICS VC 750，最大功率的25%，脉冲2s，停2s，需要注意的是，一定不要起泡沫，如果在超声的时候出现大量泡沫应该立刻停止，等泡沫消除之后再超声），加入2.5mg RNase A和100单位DNase I，室温放置1h以使蛋白质充分溶解（通常来说，如果超声比较彻底，不加核酸酶也可以）。
（5）15℃、40000g离心30min，去除不溶性沉淀，取上清，测定蛋白质浓度。
实验二 植物蛋白的酚提取法
【实验原理】
植物样品的蛋白质含量相对较低，蛋白酶/氧化酶浓度高，还有许多化合物会使组织不容易分离且干扰后续的蛋白质分离和鉴定。最主要的问题有两个：①次级代谢产物种类多，包括酚类化合物（多酚类物质会同蛋白质形成不可逆的复合物）、淀粉、油和多糖（多糖和脂质会对2-DE造成严重的干扰）；②植物细胞壁难以破碎，通常需要使用匀浆的方法（在组织匀浆的时候，许多蛋白质不可逆转地损失了，且裂解物中含有大量复杂的多糖和果胶）。此外需要注意的是，不同的植物次级代谢产物种类及含量变化很大，且不同组织之间（叶、根、果实、种子、茎）污染物的变化很大。
【实验步骤】
（1）采集新鲜的植物组织，称重后分成多份（如1～5g/份）在液氨中冷冻。
（2）研磨前用液氮预冷研钵。
（3）将冷冻的植物组织置于预冷的研钵中，加入酸洗过的0.5～10um二氧化硅（即石英砂，每克新鲜组织加0.5～5g）和PVPP［聚乙烯聚吡咯烷酮，1% ～15%（质量分数）］，研磨成很细的粉末，研磨时继续加入液氨来保证组织不解冻。不溶的PVPP可以有效地吸附酚类化合物，尤其适用于酚类化合物含量高的组织，不要使用在水系中可溶解的PVP（聚乙烯吡咯烷酮），因为它会对电泳形成干扰。但是要注意PVPP中通常可能会含有少量的PVP。一般不需要使用丙酮或TCA-丙酮来清洗沉淀，因为可能造成蛋白质在后续的步骤中难以溶解。
（4）对于纤维含量不高的组织样品，将粉末重悬在10～15mL预冷的酚提取缓冲液中，蛋白质会溶解在缓冲液中。对于富含纤维的组织，每克组织加入10～15mL酚提取缓冲液在Polytron匀浆器或者玻璃匀浆器中继续研磨。为了最大限度地降低蛋白酶的活性，样品要保持在4℃，操作要尽量快。
（5）加入等体积pH 7.5的Tris饱和酚。
（6）4℃振荡混合物30min。
（7）5000g、4℃离心30min，酚溶解的蛋白质（包含膜蛋白）、色素、脂类都在酚相中，PVPP和不溶的细胞碎片、糖类、核酸、盐都存在于水相中或者形成沉淀。
（8）由于含有蔗糖的水系缓冲液密度比酚高，所以收集上面的酚相，丢弃水相。
（9）加入同酚相体积相等的提取缓冲液。
（10）重复步骤（6）～（9）来去除仍然保留在酚相的污染物。
（11）向收集的酚相中加入5倍体积的预冷0.1mol/L乙酸铵的甲醇溶液来沉淀蛋白质。在-20℃过夜，蛋白会形成白色的沉淀（对于大多数蛋白质来说30min就可以沉淀，一般来说沉淀过夜操作比较方便）。(www.xing528.com)
（12）5000g、4℃离心30min。用枪头小心吸取上清并丢弃。
（13）加入2倍体积的冰预冷的甲醇来清洗沉淀（基于最后收集的酚相的体积），轻轻混匀。
（14）5000g、4℃离心30min。用枪头小心吸取上清并丢弃。
（15）加入2倍体积的冰预冷的甲醇来清洗沉淀（基于最后收集的酚相的体积），轻轻混匀。
（16）重复步骤（13）～（14）2次。这些步骤是为了除掉乙酸铵和酚、脂类以及色素。
（17）使用丙酮代替甲醇来重复步骤（13）～（14）2次（这样可以除掉甲醇并使之更快地干燥）。
（18）将沉淀晾干（如果发现有颜色，说明存在色素或氧化的酚类化合物的污染，可以重新用酚提取，但是要注意蛋白质可能会有损失），转移到1.5mL离心管中，使用裂解液重新溶解，离心后取上清测定蛋白质浓度。
实验三 动物脑组织蛋白样品的制备
【实验原理】
动物组织样品种类繁多，由于其中的蛋白质不像体液或者细胞培养物那样分布均匀，所以制备难度较大。组织样品制备的关键是要消除样品的不均一性且取材要纯，取材之前最好用冷的生理盐水或缓冲液来灌流，取下来之后要仔细清洗，注意保持低温并彻底研磨。脑组织的特点是脂类特别多，通常使用TCA-丙酮沉淀来去除。
【实验步骤】
（1）在冰上进行取组织的操作，用PBS（或纯水）冲去脑组织上的血液成分，称湿重并放入小烧杯中，在冰浴上用眼科剪和镊子将脑组织剪成尽可能细碎的小块（有利于匀浆）。
（2）每克剪碎后的脑组织约加入5～10mL预冷的含2g/L DTT的150g/L三氯乙酸-丙酮溶液。
（3）置冰浴上机械匀浆。
（4）将匀浆液分装于1.5mL离心管中，-20℃沉淀过夜。
（5）将分装的匀浆液于4℃、40000g离心30min，弃上清。
（6）每管加入1.2mL含2g/L DTT的预冷丙酮洗涤沉淀，Vortex振荡器中振荡多次。
（7）-20℃静置1h。
（8）4℃、40000g离心30min，弃上清。
（9）可重复步骤（6）～（8），反复洗涤沉淀，去除脑组织中大量的脂质。
（10）在通风橱中让丙酮充分挥发，得到的干燥沉淀即为脑组织蛋白质样品。
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