沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。它是分离纯化蛋白质最常用的方法。通过沉淀，将目的蛋白质转入固相沉淀或留在液相中与杂质分离。原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的。不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH、离子强度或极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。在蛋白质分离中最常用的沉淀方法有以下四种。
（一）等电点沉淀法
利用蛋白质在等电点时溶解度最低，而各种蛋白质又具有不同的等电点来分离蛋白质的方法，称为等电点沉淀法。蛋白质的等电点（pI）即蛋白质的净电荷为零时的pH。由于等电点时蛋白质净电荷为零，因而失去了水化膜和分子间的相斥作用，疏水性氨基酸残基暴露，蛋白质分子相互靠拢、聚集，最后形成沉淀析出。
一般来说，当所需pH与提取缓冲液的pH相差很远时，等电点沉淀是很有效的。例如，酸性蛋白质可在碱性条件下溶解并在低pH条件下沉淀，而碱性蛋白质可在酸性条件下溶解并在高pH条件下沉淀。但在等电点时，各种蛋白质仍有一定的溶解度而使沉淀不完全，同时许多蛋白质的等电点十分接近，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想，因而在实际工作中此法常与盐析沉淀法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。
（二）盐析沉淀法
蛋白质易溶于水，因为其分子的-COOH、-NH2和-OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1～100nm大小的亲水胶体，从而削弱了蛋白质分子之间的作用力。蛋白质分子表面的亲水基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力就越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，从而破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。
盐析沉淀是可逆的，当盐浓度降低到一定浓度时，蛋白质又可恢复胶体状态，因此，盐析沉淀一般不会破坏蛋白质的生物活性。盐析沉淀是一种简单温和的分离方法，适用于蛋白质的前期分离和后期浓缩。不同的盐浓度可有效地使蛋白质分级沉淀。
蛋白质盐析常用的中性盐主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠和磷酸钠等，其中应用最广的是硫酸铵，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点。
（1）溶解度大且不易受温度影响，尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。
（2）分离效果好，有的提取液加入适量的硫酸铵进行盐析，一步就可以除去75%的杂蛋白，纯度提高了4倍。
（3）不易引起蛋白质变性，有稳定蛋白质结构的作用。有的蛋白质用2～3mol/L的硫酸铵保存可达数年之久。
（4）pH范围广，溶解时散热少。
（5）价格便宜，不污染环境。
（6）一定浓度的硫酸铵还可以抑制细菌的生长。
最有效的方案是逐级按递增的比例将硫酸铵加入到提取液中，其间插入离心步骤。这种逐级沉淀通常被称之为硫酸铵 “分馏”。通常以20%的饱和浓度间隔较为方便。硫酸铵要在搅拌下缓慢均匀、少量、多次地加入，尤其到接近计划饱和度时，加入的速度更要慢一些，以免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。
盐析时应注意的几个问题：(www.xing528.com)
（1）盐的饱和度：盐的饱和度是影响蛋白质盐析的重要因素，不同蛋白质的盐析对盐的饱和度要求不同。分离几个混合组分的蛋白质时，盐的饱和度常由稀到浓渐次增加，每出现一种蛋白质沉淀就进行离心或过滤分离，而后再继续增加盐的饱和度，使第二种蛋白质沉淀。
（2）pH：在等电点时，蛋白质溶解度最小，故容易沉淀析出。因此，盐析时除个别情况外，pH常选择在被分离的蛋白质等电点附近。
（3）蛋白质浓度：在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，使用盐的饱和度的极限越低。蛋白质浓度高些虽然对沉淀有利，但浓度过高也容易引起其他杂蛋白的共沉作用，因此，必须选择适当浓度，尽可能避免共沉作用的干扰。
（4）温度：由于浓盐液对蛋白质有一定保护作用，盐析操作一般可在室温下进行，至于某些对热特别敏感的蛋白质，则宜维持低温条件。虽然蛋白质在盐析时对温度要求不太严格，但在中性盐下结晶纯化时，温度影响则比较明显。
（5）脱盐：蛋白质用盐析法沉淀分离后，常需及时脱盐才能获得纯品。最常用的脱盐方法是透析。
（三）有机溶剂沉淀法
有机溶剂能使蛋白质分子间极性基团的静电引力增加，而水化作用降低，促使蛋白质聚集沉淀。有机溶剂沉淀法的优点如下：
（1）分辨能力比盐析法高。
（2）沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱去有机溶剂）。乙醇是应用较广的有机溶剂。乙醇和水的结合力很强，在蛋白质溶液中加入乙醇可以破坏水化层，暴露疏水性氨基酸残基，引起蛋白质沉淀。
有机溶剂沉淀的影响因素较多，如温度、样品浓度、pH、离子强度等。使用时应注意调整，使之达到最佳的分离效果。
（四）有机聚合物沉淀法
有机聚合物是20世纪60年代发展起来的一类重要的沉淀剂，其中应用最多的是聚乙二醇（PEG）。聚乙二醇是一种非离子性水溶性聚合物，对水有很强的亲和性，溶于水时散热低，即使浓度很高时也不会引起蛋白质变性，其沉淀时间比乙醇和硫酸铵都短，而且有促进蛋白质结晶的作用，对热稳定。PEG的分子质量范围较广，目前较常用的分子质量范围是6000～20000Da。
PEG的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子质量有关，同时还受离子强度、溶液pH和温度等因素的影响。在一定的pH下，盐浓度越高，所需的PEG浓度越低；溶液的pH越接近待分离物的等电点，沉淀所需的PEG浓度越低。在一定范围内，高分子质量和高浓度的PEG沉淀效率高。
PEG沉淀的优点是：①操作条件温和，不易引起蛋白质变性；②沉淀效能高，即使用很少量的PEG也可以沉淀相当多的蛋白质；③沉淀后有机聚合物容易去除。
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