生命科学研究现场：实时观察活细胞

显微镜的放大倍率（magnification）是指最终成像的大小与原物体大小的比值。总放大倍率=物镜放大倍率×目镜放大倍率。每个物镜和目镜的放大率在其镜身上都有相应的标记，如10X、40X、100X等。值得注意的是，显微镜有效的最大放大率并不是物镜和目镜最大放大率的乘积，因为显微镜对物像的分辨能力是由物镜决定的，在给定物镜条件下，通常显微镜的有效放大倍数不能超出物镜数值孔径的50～1000倍，否则易产生畸变而失真。一般最实用的放大率在物镜数值孔径的500～700倍之间。

（一）普通光学显微镜

普通光学显微镜标本制备技术适用于光镜标本的制备技术，它分两大类：非切片法和切片法。

（1）非切片法：指不用切片机或不经过切片步骤而制成薄片的方法。常用的方法有涂片法、铺片法、压片法、离析法、磨片法等。如可制作血涂片来观察血细胞，可制备肠系膜铺片来研究肠系膜的特征等。该类方法操作简单快捷，是标本制备中的常用手段，但其缺点是应用范围有限，主要针对新鲜材料，操作时容易使材料的正常位置发生改变，通常制成的标本不能长期保存。

（2）切片法：指必须依靠手或切片机切成薄片的方法。常见的有徒手切片法、石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法等。石蜡切片法（Parafin section）是以石蜡为支持剂的切片方法，它将材料通过固定、脱水、透明等步骤，再经石蜡浸透、包埋后切成薄片。这是目前在科研和临床中应用最广的样品制作方法，其优点是：①可以很大程度上保存材料；②不适合研究易溶于乙醇等组织学、细胞学和组织化学等方面的研究；③能够切成较薄的连续切片，方便进行组有机溶剂的化学成分。石蜡切片法的缺点是：①操作步骤较多、费时；②不适合坚硬易碎、易变脆的组织和细胞通常都是无色半透明的，人们将它处理成薄片后，一般需使用染料使不同细胞组分着色，呈现出一定的反差与对比，才便于观察。

目前对石蜡切片最常用的染色方法是苏木精（hematoxylin）—伊红（ecosin）染色技术（HE染色），经过HE染色的细胞，细胞核为蓝色，细胞质为不同程度的红色。

（二）倒置显微镜和相差显微镜

（1）倒置显微镜。倒置显微镜（inverted microscope）的基本结构和成像原理与普通光学显微镜相同，主要的区别是倒置显微镜的照明系统及聚光器位于载物台的上方，物镜则位于载物台的下方，光路的走向是从上至下，与普通光学显微镜自下而上的光路方向正好相反，故称为倒置显微镜。

倒置显微镜的载物台上允许放置大而厚的标本，即需长工作距离观察的标本，其物镜和聚光镜都适合长焦距观察，但是由于工作距离的限制，其物镜的最大放大率一般为60X。在生物学、医学等领域中常进行组织培养、细胞培养等操作，其培养对象通常放置在培养皿、培养瓶或培养板中。这样的观察只适合用倒置显微镜来进行研究。值得一提的是，因为倒置显微镜主要进行的是无色透明的活体观察，故一般在倒置显微镜上选配相差、微分干涉、简易偏光等装置，以达到增强反差，提高观察效果的目的。(www.xing528.com)

（2）相差显微镜。相差显微镜（phase contrast micosocope）在结构上装配了特殊的相差装置，主要包括聚光器中环块光阑和物镜后焦面的相位板。安装了相位板的物镜称为相差物镜，在其镜身上有 “Ph”标识。

相差显微镜利用光的衍射和干涉现象，将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差）转化为肉眼可以分辨的振幅差（即明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，增强了对比度，使人眼能比较清楚地观察到未染色的细胞及细胞内的某些细微结构，如培养中的活细胞。

相差显微镜因其观察对象一般在培养皿、培养板等器皿中培养，要求载物台和物镜之间有一定的工作距离，因此基本都是在倒置显微镜的基础上加装相差装置而成的，故它也常称为倒置相差显微镜。

（三）荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜

（1）荧光显微镜荧光显微镜（fluorescence microscope）。它以一定短波长的激发光作为光源，光源照射到被检物体上，使组成标本的原子进入激发状态，释放出比人射光波长更长的可见光即荧光，再经显微镜成像系统的放大作用显示标本中的某些化学成分和细胞组分，从而对样品结构或其他组分进行定性定位定量的检测。

荧光显微镜在光学显微镜中占有重要的地位，主要是因为：①荧光显微镜所用光源的波长较短，故其分辨率高于传统显微镜；②能够直接显示细胞内的生物化学成分，且可进行多重染色，显示的彩色效果显著，极易观察并定量分析；③灵敏度高，用极低浓度的荧光染料即可显示特定成分，对活细胞毒性较小；④所用的方法非常简便易行，得出结果非常迅速，适用于医学临床诊断技术。

细胞中有些物质如叶绿体等，受紫外线照射后可自发荧光。另有些物质本身虽不发荧光，但用荧光染料或荧光抗体染色后，经短波光照射亦可发荧光。

（2）激光扫描共聚焦显微镜激光扫描。共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）主要由激光光源、荧光显微镜、扫描装置、检测系统以及用来控制扫描和显示输出的计算机等组成。目前，激光扫描共聚焦显微镜的成像质量和灵敏度不断提高，是细胞生物学等领域新一代强有力的研究工具，常用于形态学分析、细胞物理和生物化学测定、动态荧光测定、荧光漂白恢复研究、细胞间通讯研究、神经递质研究、膜电位与膜流动性研究、荧光原位杂交研究、基因定位研究，原位实时PCR产物分析，黏附细胞分选等。