细胞冻存、复苏与运输：生命科学基础研究入门成果

为了保持培养细胞的生物学特性和活力，防止其发生遗传性质的改变，减少工作量和物资的消耗，在细胞传代培养时需进行细胞冻存和复苏。

细胞低温冻存的机制目前尚不十分清楚。细胞冻存时，如不加保护剂，其内部的水将直接形成冰晶，造成细胞内部膜结构的破坏，使其很难成活。应在冻存液中加入保护剂二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）再进行细胞的冻存，保护剂可使冻存液冰点降低，在缓慢的冻存条件下，使细胞内的水分在冻存前析出细胞外，并降低电解质浓度，使低温下增加的电解质浓度所造成的损害减少到细胞能够耐受的程度。

低温对细胞的损伤取决于降温和复温的速度和条件。为了保持细胞最大的存活率，一般采用慢冻快融的方法。缓慢降温可使细胞外液先冻存出现冰晶，细胞发生脱水，细胞内不出现冰晶。在细胞从0℃降温到-25℃这一阶段，冷冻的速度在（-1～-2℃/min）为宜。当温度降至-25℃，降温速度可增至（-5～-10℃/min），到-100℃可迅速浸入液氮中。

细胞的化学和物理活性在-130℃以下最小，所以要长期保存培养的细胞，目前最广泛应用的冷冻剂是液氮。液氮的沸点是-196℃，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，对细胞的pH值没有影响，气化时不残留沉淀。冻存的细胞在复苏时必须尽快融化，使之迅速通过细胞最易受损伤的-5℃ ～0℃，以防止冰晶的损伤。

实验三　培养细胞的冻存、复苏与运输

［实验试剂］

（1）器材：HeLa细胞、超净工作台、离心机、-70℃冰箱、离心管、吸管、酒精灯、冻存管、恒温水浴箱、液氮罐。

（2）试剂：冻存液、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液、RPMI1640培养液（含5%小牛血清）。

［实验方法］

（1）细胞的冻存

从增殖期到形成致密单层以前的细胞都可用于冻存，但在冻存前一日要换1次培养液。具体操作方法如下：

①用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮细胞不经处理进行离心，除去胰蛋白酶及老的培养液，沉淀物用含10%二甲基亚砜（DMSO）的冻存培养液（预先在冰浴中冷却）在室温下重新制成细胞悬液，悬液中细胞浓度调整到106～107/mL。

冻存培养液（10mL）的组成：生长液6.8mL、小牛血清2mL、二甲基亚砜1.0mL、双抗0.1mL、5.6%NaHCO30.1mL。

②将上述细胞悬液分装成每细胞冻存管1mL，进行熔封。熔封时必须使细胞冻存管口安全封闭，同时不能使细胞冻存管内细胞悬液的温度升高。细胞冻存管上应写上细胞名称（种属号码），同时在另外纸上记录液氮保存器中该细胞冻存管支架的号码。

③细胞冻存开始时，以缓慢进行为好。即将熔封后的细胞冻存管先放到普通冰箱4℃冷藏1～2小时后取出，于-20℃低温冰箱中冷藏1～2小时，取出细胞冻存管移置于液氮罐（-196℃）中。

（2）细胞的复苏

冻存细胞的复苏以急速融化为原则。在复苏细胞的操作中，实验者必须戴面罩保护好面部和颈部。以防因为细胞冻存管熔封不完全，在贮藏过程中液氮有可能从细微的小孔中渗入细胞冻存管，加热时，液氮在细胞冻存管中迅速气化而炸裂，玻璃碎片伤害到操作者，实验者还要戴布手套，以免冻伤。(www.xing528.com)

操作步骤：①迅速取出所需细胞冻存管并立即投入37℃的水浴中（如发现细胞冻存管内细胞悬液体积增加，说明液氮已渗入细胞冻存管内，则不能投入37℃的水浴锅中），摇动细胞冻存管，使内容物完全恢复悬液状态（20～60秒）。

②将细胞冻存管浸入70%乙醇溶液中（室温下）。

③用预先浸在乙醇中的细胞冻存管瓶颈处划痕（预先划过疤的细胞的冻存无须经过此处理）。

④用消毒过的毛巾拣出细胞冻存管，在划痕处弄断瓶颈。

⑤用消毒过的移液管或注射器将内容物移到10mL以上的生长液中，混合后离心。

⑥移去上清液，加入1份新鲜培养液，混匀后开始进行细胞培养。

（3）细胞的运输

当前培养细胞既在国内进行寄赠、交换和购买，也在国际交流，为此要有装运细胞的方法。装运方法有两种：一种是用液氮或干冰贮存运输，需要用特殊容器，保存效果较好，但较麻烦，且液氮和干冰蒸发都较快，不适于长时间运行，需要空运；另一种为充液法，比较简便易行。具体方法如下：

①选生长状态良好的细胞，待接近或刚刚连接成片后，去掉培养液，充满新培养液，液量要达到培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞以胶塞，保留微量空气。空气留量过多，运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。

②妥善包装、运输。一般在4～5天内到达目的地，对细胞活力无多大影响，时间过长，则细胞活力下降。

③到达目的地后，倒出大部分培养液，只保留维持细胞生长所需的液量，置37℃培养，次日传代。

［注意事项］

①要做好冻存记录（如细胞名称、日期、罐中位置等）。

②操作时操作人员应戴手套，以免皮肤接触液氮而冻伤。

③液氮容器（罐）应有专人负责，要定期补充液氮。