细胞原代培养和传代培养快速上手

细胞培养可分为原代培养（primary culture）和传代培养（subculture）两大类。直接从生物体获取细胞在体外进行首次培养的为原代培养。从动物体分离的各种组织和器官，一种是直接进行组织块培养，将组织剪成小块，黏附在培养器皿上培养；但多数是先经过酶消化等步骤制成单细胞悬液，计数后调节至适当密度再置于合适的培养器皿中，在适宜的营养液和温度下细胞得以生存、生长和繁殖。原代培养的细胞生物学特性与体内细胞比较接近，适宜于进行细胞分化、药物检测等实验。

细胞传代培养又称继代培养（secondary culture），随着培养时间的延长和细胞不断分裂，细胞由于接触抑制、营养物的不足及代谢物积累，生长速度减慢、停止甚至会发生死亡，此时就需要将培养中的细胞从原养皿中分离、稀释后重新接种到另外的培养器皿内，再进行培养，这个过程就称为传代培养。

原代培养细胞经首次传代成功后即为细胞系（cell line），泛指能传代的细胞。其中能够连续传代细胞叫做连续细胞系或无限细胞系（infinite cell line，continuous cell line），不能连续培养的称为有限细胞系（finite cell line，limited cell line）。大多数二倍体细胞为有限细胞系，肿瘤细胞可在体外无限传代，如Gey于1951年建立的HeLa细胞（宫颈癌细胞），至今仍在沿用。

实验一　小鼠原代细胞培养

［实验原理］原代细胞培养是指直接从机体取下组织和器官制成单个细胞后立即进行培养的过程。严格的原代细胞是指培养至第一次传代之前的细胞，此时的细胞保持原有细胞的基本性质。但实际上，通常把第一代培养至第十代以内的细胞统称为原代细胞。最常用的原代细胞获得方法有组织块培养法和分散细胞培养法。

［实验器材］仪器：恒温CO2培养箱、超净工作台、培养皿、青霉素瓶、吹打管、离心管、培养瓶、移液管、纱布、手术器械、细胞计数板、低速离心机、水浴箱、脱脂酒精棉。

材料：胎鼠或新生鼠。

试剂：DMEM培养基（含10%胎牛血清）、0.25%胰酶、Hank's液、75%乙醇溶液、碘伏。

［实验步骤］

1.胰酶消化法

（1）拉颈椎将胎鼠或新生小鼠处死，置于75%乙醇溶液中，消毒2～3s（时间不宜过长，以免乙醇从鼠的口和肛门浸入体内）。再用碘伏消毒股部，取胎鼠带入超净工作台内（或将新生小鼠带入超净台内），解剖取组织，置培养皿中。

（2）加入Hank's液，洗涤三次，剔除脂肪，结缔组织，洗涤血液等。

（3）用手术剪将组织剪成小块（约1mm3），再用Hank's液洗三次，转移至小青霉素瓶中。

（4）根据组织块量，加入6倍体积的0.25%胰酶消化液，37℃中消化20～40min，每隔5min振荡（或用吹打管吹打）一次，使细胞分离，形成单个细胞悬液。

（5）加入3～5mL DMEM培养基（含10%胎牛血清）终止胰酶消化。

（6）静置5～10min，沉淀未分散的组织块，取上层悬液到离心管中。

（7）1000g，离心10min，弃去上清液。

（8）加入5mL Hank's液，制成细胞悬液，1000g，离心10min，弃去上清液。

（9）血球计数板计数，调整细胞到5×105/mL左右，转移至25mL细胞培养瓶中，置于培养箱中培养。

细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同，应根据说明添加消化酶的量。

2.组织块直接培养法

自上述方法第3步后，将组织块转移到事先铺有胎牛血清的培养瓶中。待组织块贴附于瓶底，翻转培养瓶，瓶底朝上，加入培养基，培养基勿接触组织块。37℃培养箱静置3～5h，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养基中（勿使组织漂起），37℃培养箱继续培养。

［注意事项］

（1）自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。

（2）在超净工作台中，组织细胞、培养基等不能暴露过久，以免溶液蒸发。

（3）凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。

附：Hank's液配方(www.xing528.com)

KH2PO40.06g，NaCl 8.0g，NaHCO30.35g，KCI 0.4g，葡萄糖 1.0g，Na2HPO4.H2O 0.06g.加H2O至1000mL。

注：Hank's液可以高压灭菌。4℃下保存。

实验二　细胞传代培养实验

［实验原理］贴壁细胞在培养瓶中培养，生长增殖形成单层细胞。悬浮细胞培养至充满培养基或形成细胞团后需要进行分离培养，这一操作称为传代或再培养。如拖延传代，细胞会因为增殖过度、营养缺乏和代谢产物积累而发生中毒。

（一）贴壁细胞的消化法传代步骤

［实验试剂］

（1）0.25%胰蛋白。

（2）Hank's液。

（3）含血清细胞培养基。

（4）新生小牛血清。

（5）75%Z醇溶液。

［实验步骤］

（1）吸出或倒掉瓶内旧培养基，用2mL Hank's液洗涤，吸出倒入废液缸。

（2）以25mL培养压为例，加入1mL0.25%蛋白酶（以能覆盖瓶底为限）。

（3）37℃或室温25℃以上消化3min左右。

（4）吸出或倒掉瓶内消化液，加入适当培养基用吸管轻吹打成单个细胞。

（5）以适当比例将细胞传代到新的培养瓶，加入培养基37℃培养。

如果肉眼观察到培养基混浊、暗淡，则应考虑细胞已被污染，应立即终止培养。倒微镜下观察：以Hela细胞为例，生长良好的Hela细胞，透明度大，折光性强，细胞呈扁平的多角形。胞质近中央处有圆形的细胞核，细胞间紧密联接，呈片状。生长不良的Hela细胞，细胞折光性变弱，胞质中出现空泡，细胞间隙加大，失去原有的透明状。细胞崩解、漂浮，则应尽快查清细胞死亡的原因。

（二）悬浮细胞的传代培养

［实验试剂］

（1）细胞培养基。

（2）新生小牛血清。

［实验步骤］

1.直接传代。传代前将培养瓶竖直静置约30 min，让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清液吸掉1/2～2/3，然后用吸管吹打制成细胞悬液，计数板计数（如非实验必需，不计数亦可），把细胞悬液等份分别装入数个培养瓶中，每瓶加入一定量的含10%小牛血清的细胞培养基，轻轻混匀，盖好瓶盖，置二氧化碳培养箱继续培养。

2.离心后传代。将细胞悬液移入带塞离心管内，800～1000g，离心5～8min，去上清液，加入一定量的含10%小牛血清的细胞培养基到离心管中，用吸管吹打成细胞悬液，计数板计数后（如非实验必需，不计数亦可），然后用塑料的细胞冻存管培养。