常用RNA酶抑制剂-生命科学基础研究入门

异硫氰酸胍，目前它被认为是最有效的RNase抑制剂。异硫氰酸胍不仅能有效破坏细胞结构使核蛋白解聚从而释放出 RNA，还能强烈抑制 RNase活性。焦碳酸二乙酯（DEPC）是一种有效但抑制RNase活性不完全的抑制剂，它同时也是一种RNase的化学基团修饰剂。DEPC抑制RNase活性的机制是通过与RNase的功能基团组氨酸残基的咪唑基结合而使RNase变性失活。由于DEPC与氨水接触后易产生致癌物，因此使用过程中需要特别小心。蛋白类抑制剂（RNasin）是一种RNase的非竞争性抑制剂，可与几种RNase结合而使它们失活。RNasin是从鼠肝或人胎盘中提取的酸性糖蛋白。钒氧核苷酸复合物是一种强烈的RNase抑制剂，由钒离子的氧化型与核苷酸结合而形成。其他如SDS、尿素、硅藻土等对RNase也有一定抑制作用。

1.防止RNA酶污染的措施

（1）尽可能在实验室专门设立RNA操作区，RNA操作区应保持清洁、干净，并定期除菌。

（2）离心机、微量移液器、试剂等均应专用。

（3）实验过程中，操作人员需自始至终均戴一次性口罩和手套，并注意时常更换新的口罩和手套，这样可避免操作人员身体上的微生物及自身产生的RNase污染实验用具或实验试剂。

（4）最好使用一次性离心管、枪头等塑料用具以防交叉污染。对于一次性塑料制品，建议使用厂家供应的出厂前已经灭菌的制品，买来后不需清洗、灭菌，可直接用于RNA提取实验。因为用DEPC等处理的重复使用的塑料制品往往由于多次RNase污染而使RNA提取结果不理想。

（5）用高温、高压对所有清洗好并干燥的玻璃器皿进行灭菌，灭菌时间至少在6h以上。不能用DEPC浸泡处理的实验器具，可采用氯仿多次冲洗或擦拭以灭活RNase。不能使用高温高压灭菌的塑料制品，需用0.1%DEPC浸泡过夜或反复用氯仿冲洗数次。

（6）制胶模具、电泳槽等有机玻璃器具需先用洗涤剂清洗，ddH2O冲洗干净，无水乙醇干燥，再用3%H2O2溶液室温下浸泡10min，最后用0.1%DEPC水冲洗数次，自然晾干。

（7）配制试剂用的乙醇、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶装试剂。配制试剂所需在用水应含有0.1%的DEPC。配置好的试剂需先在37℃放置至少12h，接着再用高温高压去除残留在试剂中的DEPC。不能高温高压灭菌的实验试剂要先用DEPC处理的无菌双蒸水配制，再用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

实验一　细菌RNA的提取与纯化

【实验步骤】

（1）在1.5mL塑料离心管中离心收集0.2～1.5mL新鲜细菌（注意：因为细菌RNA半衰期十分短，所以必须使用最新鲜的细菌），吸尽液体培养基，加入1mL细菌RNAout并用移液枪充分吹打，确保细菌全部裂解，没有块状物。如果使用菌落，则用接种环小心将其转移到装有1mL细菌RNAout的1.5mL塑料离心管中，用移液枪吹打均匀。

（2）加入0.2mL氯仿，在振荡器上充分振荡混均30s（必须将管底的液体振荡起来，否则不能有效将DNA打断和去除蛋白质）。

（3）12000～15000g室温离心3min。上清液无色，下层液呈蓝色，中间为蛋白质。小心将上清液转移到另一干净1.5mL塑料离心管中，上清液体积约为0.6mL。为避免触及中间层的DNA和蛋白质，建议分小量多次吸取，并且只取0.5mL，留0.1mL左右。当细菌数量较少时，中间层十分松散，吸取上清时很容易吸到下层有机相，需要更加小心。

（4）在上清液中加入等体积的异丙醇，振荡器上振荡混匀30s。

（5）12000～15000g室温离心3～10min，RNA将在管底侧面形成沉淀。

（6）小心吸弃上清液，注意不要吸取RNA沉淀。

（7）在离心管中加入1mL 75%乙醇，振荡器上振荡混匀30s。

（8）12000～15000g室温离心1min。

（9）小心吸取上清液，注意不要吸取RNA沉淀。

（10）重复步骤（8）和（9）一次。

（11）短暂快速离心，用移液枪小心吸取残留液（约50μL）。

（12）短暂放置1～2min后加入适量RNA溶解液使RNA沉淀溶解，可以立即使用或存放于-80℃长期保存。

（13）RNA完整性的电泳检测：如果需要做Northern杂交，强烈建议使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA分子。如果是简单检测，可以使用TAE缓冲电泳液，但上样时必须使用变性上样液。普通DNA上样液不含变性剂，也没经过去RNase处理，所以最好不要使用。尤其需要注意的是，不要使用TBE进行RNA电泳，因为TBE所含的硼酸是研究多糖的经典方法——硼酸络合法中的关键成分，硼酸通过与RNA核糖中的羟基发生络合反应，形成RNA分子内或RNA分子间的络合复合物，使同样长度的RNA具有不同的泳动速度，电泳条带弥散，同时有大的RNA络合复合物迟留在加样孔中（一般会误以为是基因组DNA污染）。RNA分子内或RNA分子间络合物形成的多少和比例又与硼酸和RNA的数量比例有关，而RNA样品中污染的其他多糖（如植物中提取的RNA）也会参与此反应，使硼酸对RNA电泳的影响更复杂，所以TBE对RNA电泳的影响没有规律性和重复性。有的样品可以使用有的又不行，最好是避免使用。由于细菌细胞中70% ～80%的RNA为rRNA，后者又由23S（约3700nt）、16S（约1700nt）和5S（约100 nt）三种组成，所以变性胶电泳后应该在紫外线下看见三条清晰的rRNA带。由于核酸长度与结合EB的数量成正比（当然还与RNA的二级结构有关，双链部分结合能力比单链部分强），所以23S rRNA条带的荧光强度一般比16S rRNA条带的荧光强度强2倍。如果这两条rRNA带不清晰或比例小于此范围则表示RNA有降解（因为大的RNA被酶降解的可能更大）。

（14）RNA产量产率测定：将5～10μl RNA溶于TE缓冲液中（pH值7.5～8.2之间）检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度（OD260为1的RNA=40μg/mL），进而计算出RNA的产量和产率。注意不要将RNA稀释在DEPC水中检测OD260和OD280，否则光吸收比在TE中测得的低10%～15%，因为核酸光吸收跟溶液pH值相关，而DEPC水中的DEPC高压分解后产生的CO2与水反应生成碳酸，使溶液pH值降低进而降低RNA的光吸收。

（15）RNA纯度测定无污染的总RNA的OD260/OD280一般在1.8～2.1之间（具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关），OD260/OD280一般在2.0～2.3之间，如果低于或高于此范围，则分别表示样品可能有蛋白质或多糖的污染，但一般不影响RT-PCR等反应。蛋白质污染可以通过酚、氯仿抽提一次然后用乙醇沉淀去除，DNA和多糖污染可以分别用天泽基因的DNAErasol和PS Erasol去除。

实验二　植物RNA的提取与纯化

提取植物RNA有很多方法，目前应用较多的有CTAB法、SDS法、异硫氰酸胍法、热硼酸盐法以及商业试剂盒Trizal等。由于不同植物、相同植物的不同部位都有其各自的生理结构特点，因此没有一种方法适用于所有的植物组织，不能用一成不变的操作去提取不同植物材料的RNA，而必须在熟悉RNA提取基本原理及要点的情况下，根据各种方法自身的特点对提取方法进行筛选和适当的改进，才能获得一种对目的材料高效的RNA提取方法。

（一）植物总RNA的提取

1.异硫氰酸胍法

异硫氰酸胍法是强烈的蛋白质变性剂，它不仅能强烈抑制RNA酶的活性，还能有效地裂解高核蛋白与核酸复合体，与加入的β-巯基乙醇和N-月桂酰基氨钠（Sarkoyl）共同对RNA产生强烈的抑制作用。

2.CTAB法

该法以CTAB为变性剂，利用较高浓度的CTAB不仅能对植物细胞有较好的裂解作用，而且它还能有效地分离核蛋白与核酸的复合物，同时沉淀总核酸，然后再选择性地分离出RNA。该法的主要步骤如下：称取样品0.3～0.5g，置于含液氮的研钵中研磨成粉末状，迅速转入1.5mL离心管中，每管提前加入1mL的65℃预热30min的提取液，用手剧烈摇动，充分混匀，于65℃水浴20min；4℃条件下12000g离心10min，吸取上清于新离心管中，每管加入等体积水饱和酚、氯仿、异戊醇，颠倒混匀，冰上放置10min；4℃条件下12000g离心10min，取上清于新离心管中进行RNA的沉淀。上清加入1/10倍体积3mol/L CH3COOONa（pH值5.2）和2.5倍体积-20℃预冷的无水乙醇，混匀后-20℃放置2 h以上，4℃条件下12000g离心10min；弃上清，70%乙醇清洗沉淀两次，于超净工作台晾干，加适量DEPC水完全溶解，-20℃保存备用。CTAB法是核酸提取的常用方法，它不仅适用于植物总RNA的大量提取，而且也适用于DNA的提取。

3.热硼酸法

热硼酸法在提取过程中经强烈振荡和温浴，能提高RNA的产量。该技术将硼酸缓冲体系、蛋白酶化合物依靠氢键形成复合物，二硫苏糖醇（DDT）作为还原剂，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可与多酚化合物形成复合体，它们都可以抑制植物组织中酚类物质与RNA结合氧化以及酚类物质的氧化而使RNA分开。因此，该技术非常适用于富含酚类物质的植物组织中总RNA的提取。

4.Trizol试剂快速提取法

Trizol试剂快速提取法的特点是快速、高效。取适量样品加入Trizol试剂于室温下静置5min，使核蛋白充分解离后，加入0.2mL氯仿，充分震荡15s并于室温下静置2～3min，在4℃下12000g离心15min，取上清加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，于室温静置10min后，在管底会出现胶状沉淀，即为RNA；再在4℃下12000g离心10min后弃上清，向沉淀中加入1mL 75%乙醇，轻轻混匀后于4℃下7500g离心5min后弃上清，将RNA样品自然晾干，之后加入适量DEPC水溶解即可。

（二）植物总RNA的纯化

1.去除酚类物质

一般用如Li+、Ca2+等沉淀、离心、苯酚/氯仿抽取等方法去除，但这只能去除未被氧化的酚类物质，因此在提取总RNA的初始阶段要注意防止酚类被氧化。抑制酚类被氧化的方法一般有：①还原剂法，一般在提取缓冲液中加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂，能有效抑制酚类物质的氧化；②螯合剂法，采用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）与酚类化合物形成螯合物，使之不能成为多酚氧化酶的底物而抑制它们的氧化，并可在以后的抽提过程中除去这些螯合物；③此外还有牛血清白蛋白法（BSA）、Tris硼酸法、丙酮法均可抑制酚类化合物的氧化。

2.去除多糖类物质

多糖在植物组织中含量丰富，用盐酸胍处理可以除去一些多糖，用LiCl沉淀可将部分多糖留在上清液中，用低浓度的乙醇可沉淀多糖，也可用醋酸钾沉淀多糖。缓冲液中高浓度的NaCl或加入一定浓度的2-丁氧乙醇也有助于除去多糖。

3.去除蛋白质类物质(www.xing528.com)

在提取缓冲液中加入蛋白质变性剂，如异硫氢酸胍、盐酸胍、巯基乙醇-苯酚、SDS、CTAB等可去除大部分蛋白质，也可以利用蛋白酶K降解蛋白杂质，最后再用苯酚/氯仿抽取去残存的蛋白质。

2.去除次级代谢产物

在植物组织中次级代谢产物很容易与RNA结合并被共同抽提出来，从而阻碍RNA的分离。因不能确定这些次级代谢产物是什么物质，所以，目前还没有特别好的方法来解决这一问题。一般用选择性沉淀和梯度离心等方法来纯化。

（三）植物mRNA的提取与纯化

从植物组织或细胞中提取mRNA，通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链，将双链cDNA和载体连接，然后转化扩增，即可获得cDNA文库，构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析；比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学研究的基本手段。自20世纪70年代首例cDNA克隆问世以来，人们现已发展了许多种提高cDNA合成效率的方法，并大大改进了载体系统，目前cDNA合成试剂已商品化。cDNA合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链，聚合酶合成cDNA第二链，加入合成接头以及将双链DNA克隆到于适当载体（噬菌体或质粒）。

1.植物mRNA的提取

与rRNA和tRNA不同，由于mRNA末端含有多Poly（A）+，当总RNA流经Oligo（dT）纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在Oligo（dT）纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次Oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。

2.真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5'端帽子结构（m7G）和3’端的Poly（A）尾巴。这种结构为真核细胞mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲和色谐分离纯化mRNA的理论基础就在于此。mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱色谱法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3'末端含有Poly（A）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。

（四）植物microRNA的提取与纯化

植物microRNA（miRNA）是一类由21～24个核苷酸组成的小分子RNA。在细胞核中它将非编码的茎环结构的单链RNA前体（pri-miRNA）加工成miRNA/miRNA双链，然后运到细胞质中解开双链。成熟miRNA通过形成miRNA诱导的沉默复合物（miRNA-induced silencing complex，miRISC）与靶标mRNA互补配对结合，并对其进行剪切或抑制翻译，实现对靶标基因的负调控。miRNA在植物发育、信号转导、抗逆反应等方面起着重要作用。

植物microRNA的提取与纯化技术大体与总RNA的提取纯化方法，关键技术在于提取RNA的基础上回收纯化21～24个核苷酸组成的小分子RNA。目前，主要采用的技术是离心柱吸附法。该法是将小分子RNA吸附于离心柱内特殊硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗—离心的步骤，漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质进一步去除，最后利用低盐的洗脱液将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

实验三　动物RNA的提取与纯化

（一）动物总RNA的提取与纯化

RNA提取的方法包括（异）硫氰酸胍—酚—氯仿法、总RNA的试剂盒快速提取法、磁珠法、蛋白酶—热酚法、氧化锂法提取总RNA等。

1.（异）硫氰酸胍—酚—氯仿一步法

总RNA提取法中最常使用的是（异）硫氰酸胍—酚—氯仿法，是经典的一步法，它以含4mmol/L的（异）硫氰酸胍与0.1mmol/L的β巯基乙醇的变性溶液裂解细胞，然后在pH告4.0的酸性条件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤来制备RNA。由于RNase的影响，为获得完整的RNA分子，就必须在总RNA分离纯化的最初阶段，尽可能快地灭活胞内RNase的活性。在F巯基乙醇的协同作用下，高浓度的（异）硫氰酸胍可以极大、极快地抑制RNase的活性，能从胰腺等富含RNase的组织细胞中分离出完整的RNA分子，目前已成为常规使用的试剂。在RNA纯化时，使用pH值4.5～5.5的水饱和酸性酚，既有利于DNA的变性又有利于RNA的分离。尽管RNA对剪切力不敏感，但RNA具有碱易变性，需要严格控制pH值。另外，在RNA的提取过程中，酚与氯仿经常结合、交替使用，主要在于两者合用时去除蛋白质的效果更好，而且氯仿还能有效抑制RNase的活性，通过使酚脱水防止mRNA的丢失，加速有机相与水相的分层，去除植物色素和蔗糖以及核酸样品中的痕量酚。少量异戊醇的加入，其目的在于消除抽提过程中因蛋白质变性而产生的泡沫。由于高浓度胍类的使用，为防止SDS的沉淀，常改用十二烷基肌氨酸钠。对含量较低的样品，加入糖原可以提高RNA的回收率。

该法与以前的（异）硫氰酸胍-CsCl超速离心法相比，具有简便、经济、高效和灵活的特点，能同时迅速地处理多个标本，且RNA的完整性与纯度均很高。目前该法仍用于从培养细胞和大多数动物组织中分离纯化总RNA。总RNA的产量取决于标本的起始量，每毫克组织总RNA的产量为4～7μg，每106个细胞为5～10μg。但该法不适合从富含甘油三酯的脂肪组织中提取RNA，而且有时提取的RNA会带有多糖和蛋白多糖的污染，这些污染将影响乙醇沉淀后RNA的溶解，同时抑制RT-PCR反应，并通过结合到膜上而影响RNA杂交中的印迹步骤。脂肪组织RNA的提取可换用（异）硫氰酸胍-CsCl超速离心法。当多糖与蛋白多糖的污染比较严重时，可通过增加有机溶剂的抽提步骤并改变RNA的沉淀条件而加以消除。需要指出的是，目前常用的一步法均以异丙醇沉淀RNA，由于其选择性地沉淀大分子rRNA和mRNA，故提取的总RNA中含有的小分子量RNA较少，rRNA和mRNA所占的比例相应增高。

2.（异）硫氰酸胍—酚—氯仿二步法

此外还有可同时制备RNA、DNA与蛋白质的二步法，该法是（异）硫氰酸胍—酚—氯仿—步法的改进方法。它是以（异）硫氰酸胍酚的单相裂解试剂裂解细胞，然后加入氯仿后形成两相。变性的DNA与蛋白质位于两相的界面，保留位于上层水相的RNA，在RNA沉淀溶液中通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤进行制备。其中RNA沉淀溶液的成分为1.2mmol/L的NaCl与0.8mmol/L的柠檬酸二钠。由于RNA沉淀溶液的使用，该法制备的RNA样品极少有多糖与蛋白多糖的污染，可用于mRNA的纯化、Northern杂交、逆转录和RT-PCR反应等。处于界面的DNA与蛋白质可通过乙醇和异丙醇分别分级沉淀出来。该法制备的DNA，大小约为20kb，可作PCR反应的模板，蛋白质样品则主要用于免疫印迹。目前，该法已有多种商品化的单相裂解试剂供选择，是最常用的总RNA提取法，其产率与（异）硫氰酸胍—酚—氯仿一步法相当。

3.总RNA的试剂盒快速提取法

提取总RNA的试剂盒采用独特的裂解液/β巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，然后用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内的硅基质膜上，再通过一系列快速的漂洗—离心步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的RNasefreeH20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。该方法快速、高效，RNA分离的纯度高，可满足后续实验的各种要求。

4.磁珠法

磁珠法分离RNA是采用具有独特分离作用的磁珠和独特的缓冲液系统，从血清、血浆等样本中分离纯化高质量的RNA。独特包埋的磁珠，在一定条件下对RNA具有很强的亲和力，而当条件改变时，磁珠释放吸附的RNA，能够达到快速分离纯化RNA的目的。整个过程不涉及有机试剂，该法安全、便捷、快速，提取的RNA纯度高，质量稳定可靠，提取得到的RNA可用于RT-PCR检测、qRT-PCR检测等各种精密实验。

5.其他方法

RNA的分离纯化方法与方案还有许多，如（异）硫氰酸胍-CsCl超速离心法、盐酸胍-有机溶剂法、LiCl-尿素法、蛋白酶-热酚法等，因各种原因目前已较少使用。

（二）动物mRNA的提取与纯化

与大小和序列明确的rRNA、tRNA及核内小分子RNA不同，真核生物的mRNA在细胞中含量少、种类多、分子量大小不一。除血红蛋白及某些组蛋白外，绝大多数mRNA在其末端带有一个长短不一的多聚腺苷酸（polyadenylic acid）的结构，即Poly（A）尾巴。以总RNA制品为起始材料，利用核酸的碱基配对原理，通过Oligo（dT）-纤维素或Poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和色谱，可以很容易地同时分离不同种类与大小的mRNA的分子群体。理论上，它们可编码细胞内所有的蛋白质与多肽分子。

1.Oligo（dT）-纤维素柱色谱法

Oligo（dT）纤维素柱色谱法是mRNA制备的一个标准方法。它是以Oligo（dT）-纤维素填充色谱柱，加入待分离的总RNA样品，其中Poly（A）+RNA在高盐条件下，通过碱基互补，与Oligo（dT）-纤维素形成稳定的RNA-DNA杂交体，洗去未结合的其他RNA，然后在低盐缓冲液中洗脱并回收Poly（A）+RNA。要从哺乳动物细胞提取大量的非放射性RNA时，Oligo（dT）-纤维素柱色谱法是首选方法，回收的Poly（A）+RNA量可达总RNA的1%～10%。但该法分离速度慢，易阻塞，不适合同时对多个标本的处理，而且很难回收全部的Poly（A）+RNA，故不适合对少量RNA样品的分离。

2.Oligo（dT）-纤维素液相结合离心法

为适应同时对多个标本进行处理的要求，应选用批量的色谱法。Oligo（dT）-纤维素液相结合离心法不经填柱，而是直接将Oligo（dT）纤维素加入到一系列的含不同RNA样品的微量离心管中，通过离心收集吸附有Poly（A）+RNA的Oligo（dT）-纤维素，经漂洗后，用含70%的乙醇洗脱液将吸附的Poly（A）+RNA从Oligo（dT）纤维素上洗脱并沉淀出来。该法可同时批量处理多个样品，而且能从少量的RNA样品中分离出Poly（A）+RNA。用本法分离Poly（A）+RNA时，应选用等级较高的Oligo（dT）纤维素，如Oligo（dT）18-30纤维素，而一般的柱色谱填充的是Oligo（dT）12-18纤维素 。

3.其他方法

磁珠分离法则联合利用了Oligo（dT）与Poly（A）的互补配对特性、生物素（biotin）与链霉亲和素（streptavidin）的特异性结合以及磁性分离原理，对Poly（A）+RNA进行高效、灵敏、快速的分离。其产量甚至比常规的Oligo（dT）-纤维素柱色谱法还高，且分离的Poly（A）+RNA能用于几乎所有的分子生物学实验。但它对组织或细胞的最大处理量每次不超过1g。而且磁珠价格昂贵并且需要专门的磁性分离架。

（三）动物microRNA的提取与纯化

microRNA（miRNA）在基因表达调控中起着至关重要的作用，它不仅和细胞的发育、分化、凋亡等关系密切，而且与多种癌症和疾病息息相关。无论是芯片分析，还是miRNA的克隆、miRNA表达谱分析，都需要分离和纯化小分子RNA。以往传统的RNA提取试剂盒都是为了回收mRNA而设计的，往往会弃去较小的RNA分子以提高mRNA的得率，而这些步骤会导致miRNA的损失。多数RNA纯化试剂盒采用标准的玻璃纤维滤膜或者硅胶滤膜，不能有效地回收小分子RNA。不过，为了顺应市场的需求，各大公司纷纷推出miRNA提取产品。目前市场上的miRNA试剂盒主要针对于培养的细胞和动物的组织，血清、石蜡包埋组织、多糖多酚植物的小RNA等由于样本本身的特殊性很难提取，因此针对不同类型的样本具有不同的miRNA提取方法。

1.培养的细胞和动物的组织

最早用于此类型样本的试剂盒是由Ambion公司推出的，它采用改良的玻璃纤维滤膜方法来快速回收细胞或组织样本中全部RNA。包括miRNA。首先用胍盐裂解，让RNase失活，使RNA稳定，随后加入酸性酚/氯仿来萃取，去除大部分细胞成分，最后通过两个玻璃纤维滤膜吸附柱分别提取总RNA和miRNA。其他公司如Qiagen、Invitrogen、Sigma等也纷纷推出原理类似的试剂盒。

2.全血、血清

从全血、血清中提取miRNA，需先用裂解液直接裂解全血和血清，灭活RNase，然后用有机试剂抽提去除蛋白质和DNA，采用吸附柱对miRNA进行吸附，再通过一系列的漂洗—离心，将细胞代谢物、蛋白质等杂质进一步去除，最后用低盐的洗脱液将miRNA从吸附柱上洗脱。

3.石蜡组织

从石蜡组织中提取miRNA，通常需先用二甲苯脱蜡，乙醇洗涤之后再用裂解液、SDS和蛋白酶K处理，后面的流程就与普通的组织一样。