质粒DNA提取分离：生命科学基础研究入门

质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子，常以双链、共价闭合的环状形式存在。它能自主复制；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；它具有两个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；它分子量小，以容纳较大的外源DNA。

（一）质粒提取原理

采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）和Trion X 100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或TritonX-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着于细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，细菌染色体易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成大小不同的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环DNA的两条链不会分离。当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，与变性蛋白质或细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复至原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以可溶状态存在于液相中。在细菌细胞内，共价闭合环状质粒以超螺旋形式存在。在质粒提取过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其他形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而使链的张力得以消除，形成松弛型的环状分子，称开环DNA；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA。对提取的质粒DNA进行电泳时，超螺旋质粒DNA的泳动速度比开环和线状分子的泳动速度快。

从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：①培养细菌使质粒扩增；②收集和裂解细胞；③分离和纯化质粒DNA。

1.抽提质粒中的常见问题

提不出质粒或者质粒提取量很少。

（1）菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

（2）质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。

（3）菌种老化：若是甘油保藏菌，需要在活化后再培养摇菌；建议涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

（4）吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，如TB或者2×YT，菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率，则需调整LB培养液体积。

（5）碱裂解不充分：使用过多的菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量。

（6）溶液使用不当：溶液Ⅱ和Ⅲ在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。

（7）洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位，以确保洗脱液会完全覆盖硅胶。膜的表面，达到最大洗脱效率。

（8）洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，pH洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH7.0～8.5之间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。

（9）洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。

（10）洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定的影响。洗脱时放置1min可达到较好的效果。

（11）乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。

（12）质粒未全部溶解：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

质粒纯度不高。

（1）混有蛋白质：不要过多使用菌体。

（2）混有RNA 。

（3）混有基因组DNA。

（4）宿主菌含大量核酸酶。

（5）裂解时间过长。

（6）质粒的二聚体和多聚体形式。

2.质粒浓度的检测

DNA纯度的判断大多根据OD260/OD280的比值检测，符合要求、纯度高的DNA样品其OD260/OD280在1.8～2.0之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。

DNA的纯度也可以根据OD260/OD230的比值判断，OD230主要评估样品中是否存在一些有机污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等。纯度较高的DNA样品OD260/OD230的比值在2.0～2.5之间，比值小于2.0则表示存在有机物的污染，如乙醇或者酚类残留。如果遇到此种情况，可以再沉淀一次，然后重复乙醇洗涤的过程。

3.质粒DNA提取常用方法比较

表1　质粒DNA提取常用方法比较

（二）染色体DNA的提取与分离

1.提取基本步骤

（1）部分酶切基因组DNA；

（2）电泳分离；

（3）部分酶切DNA与载体连接；

（4）导入大肠杆菌；

（5）构建基因组DNA文库。

在基因组分析和基因组文库构建中，需要高纯度、高分子质量的基因组DNA，其提取过程包括：

①破碎细胞；

②去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子；

③去除盐类、有机溶剂等杂质；

④浓缩和溶解DNA。

基因组DNA在同一个体的不同组织中差别不大。鼠肝、兔肝、人血、白细胞是提取哺乳动物基因组DNA最合适的材料，用鼠的尾巴也能获得高纯度的基因组DNA。对于植物而言，常用幼叶或子叶作为提取材料。几乎所有的基因组DNA提取方法都使用了高浓度盐或EDTA（也有抑制DNase活性的作用）等物质将蛋白质和DNA分开，或者用蛋白酶K降解蛋白质。

实验一　细菌基因组DNA的制备——小量制备细菌基因组DNA

【实验原理】

溶解细菌，用蛋白酶K消化以去除蛋白质。通过用溴化十六烷三甲基铵选择性沉淀以去除细胞壁碎片、多糖和残余的蛋白，产生的上清液，经异丙醇沉淀，获取相对分子质量较高的DNA。

【实验材料与主要试剂】

1.材料：细菌。

2.试剂：TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA）、10%十二烷基磺酸钠（SDS）、5mol/L NaCl、20mg/mL蛋白酶K（分装储存在-20℃冰箱）、溴化十六烷三甲基铵/氯化钠溶液（CTAB/NaCl溶液，10%CTAB，0.7mol/L NaCl）、24∶1氯仿/异戊醇、异丙醇、70%乙醇。

【实验步骤】

1.将5mL培养液和所需要的细菌一起孵育。在与该株细菌相应的条件下（即相应的培养液、药物选择、温度）培养，直至达到饱和。这可能需要几小时到几天，取决于细菌的生长速度。

2.离心2min，直至培养液形成结实的小块，弃去上清液。

3.加入567μL的TE缓冲液，用吸管反复吹打以重新混悬离心沉淀小块。加入30μL 10%的SDS和3μL 20mg/mL蛋白酶K，使其终浓度分别为0.5%和100μg/mL。彻底混匀，在37℃孵育1h。由于去垢剂溶解细菌细胞壁，溶液变得黏稠，不必要用溶菌酶预先消化细菌细胞壁。

4.加入100μL 5mol/L NaCl，充分混匀。这一步骤是极其重要的，如果盐的浓度在室温下降低，低于0.5mol/L，将会形成CTAB核酸沉淀（Murray and Thompson，1980）。此步骤可去除细胞壁碎片、变性的蛋白以及与CTAB结合的多糖，而保留溶液中的核酸。

5.加入80μL的CTAB/氯化钠溶液，充分混匀，65℃孵育10min。

6.加入等体积氯仿/异戊醇（0.7～0.8mL），充分混匀，离心4～5min。这一抽提步骤是去除CTAB的蛋白/多糖复合物，离心后可见到白色的分界面。

7.将黏稠的上清液移入新的离心管，留下交界面，向上清液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，充分抽提，离心5min。对某些菌株，氯仿抽提之后形成的交界面不够坚实，使得收集上清液较为困难。在这种情况下，可以用消毒的牙签，挑除大部分的交界面，然后再收集上清液。残存的CTAB沉淀可用酚/氯仿/异戊醇抽提去除。

8.将上清液转入新的试管，加入0.6倍体积的异丙醇沉淀核酸。没有必要加盐，因为氯化钠的浓度已经很高。将试管来回振动摇晃，直至可明显见到白色纤维状的DNA沉淀。这时，可以将白色纤维状的DNA沉淀物转入装有70%乙醇的新的试管。具体方法是，将一根细的吸管的末端加热加以封口，然后在煤气灯火焰旁弯成钩状，就可以用末端的钩，将DNA沉淀转移到新的装有70%乙醇的试管里。另外，也可以在室温下短时离心，以收集沉淀物。

假如以上步骤并不形成DNA沉淀，这表明DNA被剪切成相对分子质量较低的片段。如果基因组DNA用来进行限制性内切酶酶切、Southern Blot分析，则可以通过简单的离心沉淀DNA。

9.用70%的乙醇洗涤DNA，以去除残余的CTAB，然后在室温下再离心沉淀DNA。小心去除上清液，冻干机中短暂干燥沉淀。

10.将离心沉淀的DNA重新溶解在100μL的TE缓冲液中。这可能要花费一些时间（可能1h），因为这种DNA是相对分子质量高的。一般10个单位的EcoRI消化15μL的这种DNA要1h。

基本方法中的步骤4～10可以适用于细菌染色体DNA制备物中多糖和其他大分子污染物的去除。将DNA溶液中的氯化钠浓度调到0.7mol/L，加入0.1倍体积的CTAB/NaCl溶液；CTAB抽提步骤5～6可以重复几次，直至交界面消失为止。这些措施将更有利于基因组DNA制备物中多糖的去除。

附：细菌基因组DNA的快速小量制备（1.5mL）。

1.培养细菌至饱和。

2.取1.5mL离心2min。

3.以567μL的TE缓冲液，重新混悬，加入30μL 20mg/mL的蛋白酶K混匀，在27℃孵育1h。

4.加入100μL 5mol/L的NaCl，充分混匀。

5.加入80μL的CTAB/NaCl溶液，混匀，在65℃孵育10min。

6.用等体积的氯仿/异戊醇抽提，离心5min。(www.xing528.com)

7.将水相移入一新的试管，用酚/氯仿/异戊醇抽提，离心5min。

8.将水相转入一新的试管，用0.6倍体积的异丙醇沉淀，70%乙醇洗涤沉淀，弃去上清液，在冻干机中干燥沉淀物。

9.将沉淀物重新混悬在100μL的TE缓冲液中。

实验二　植物基因组DNA的制备

【实验原理】

植物细胞用去垢剂Sarkosyl溶解，溶解物用蛋白酶K消化。去除溶解物中不溶性的碎片之后，沉淀核酸，用氯化铯梯度离心纯化DNA。

【实验仪器、材料与主要试剂】

1.仪器

贝克曼JA-14、JA-20或JA21和VTi81转头（或类似转头）、5mL超速离心管、15G针和针筒。

2.材料

新鲜的植物组织。

3.试剂

消毒的冷水、液氮、异丙醇、氯化铯、乙醇、3mol/L醋酸钠，pH为5.2；抽提缓冲液（100mmol/L Tris-HCl pH8.0，100mmol/L EDTA，250mmol/L NaCl临用前加入100μg/mL蛋白酶K）；10%（m/V）氮—十二烷酰肌氨酸（sarkosyl）；TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA）；10mg/mL溴化乙啶、氯化铯饱和的异丙醇。

【实验步骤】

1.组织的制备

（1）收集10～50g新鲜的植物组织。在收集之前，将植物放置在黑暗中1～2d，以降低组织中的淀粉含量。较年轻的植物是较好的组织来源，因为其所含的多糖较低。

（2）以消毒的冷水洗涤组织，以去除黏附、干燥的碎片和污迹。

（3）将组织用液氮冰冻，用研钵将组织碾成粉末。整个过程中，保持组织呈冰冷状态，方法是间断地加入液氮。

2.细胞的溶解与消化

（4）将冰冻的粉末转移到250mL的离心管中，并立即加入抽提缓冲液。一般而言，每克新鲜的植物组织，加5～10mL的抽提缓冲液。温和搅拌以分散组织。

（5）加入大约10%（V/V）体积的氮—十二烷酰肌氨酸，使其终浓度为1%。

在用抽提缓冲液将组织重新混悬之后，再加入氮—十二烷酰肌氨酸是重要的。如果氮—十二烷酰肌氨酸先加入抽提缓冲液中，植物细胞的不完全溶解会干扰组织的分散，并导致DNA的不必要切断。

（6）55℃下孵育1 ～2h。

溶解物应该清亮透明（或绿色的）和具有微黏性。根据这一点，溶液的操作应该温和，以免DNA被切断，不能旋转振荡或以暴力混合。

（7）将溶解物于Beckman转子JA-4中，4℃，以6000r/min（5500×g）的速度离心10min，收获上清液。如果有必要去除未消化的碎片，再次离心。

3.DNA的沉淀

（1）在上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，温和混匀，可见到核酸沉淀。假如见不到沉淀，-20℃下放置30min。

（2）Beckman JA-14转头，4℃的温度下，以8000r/min（7500×g）的速度离心15min。去除上清液。不要让核酸沉淀物干燥，否则它将变得很难溶解。

4.DNA的纯化

（1）9mL的TE缓冲液重悬沉淀。必要时，在55℃孵育，以帮助混悬。加入9.7g的固体氯化铯，温和混合直至溶解。

（2）冰浴中孵育溶解物30min。在JA-20转头中，4℃下，以8000r/min（7500×g）的速度离心10min，收获上清液。这一步骤可去除溶解物中一些不溶性的碎片。此外，离心后，溶液的上部可形成小的分离相，这是由于溶解物中残留Sarkosyl。通过用双层干酪包布过滤上清液，可以将Sarkosyl去除掉。收集上清液，但去除顶部的Sarkosyl相。

（3）加入0.5mL 10mg/mL的溴化乙啶，冰浴30min。请注意：溴化乙啶是诱变剂，应小心，并戴手套。

（4）4℃的温度下，以8000r/min（7500×g）速度离心10min。这一步将形成大的RNA沉淀物，就这一点而言，溶解物中的许多不需要的成分（RNA、蛋白质和碳水化合物）已经去掉了。

（5）将上清液转移到两个5mL的密封超离心管中，密封离心管。要保证这两个离心管是装满了的。经过了平衡并密封完好。

（6）在Beckman VTi80转头中，20℃，以80000r/min（525000×g）的速度离心4h，或者20℃下以60000r/min（300000×g）的速度离心过夜。

（7）用大孔的针（15G）和针筒收集DNA条带。首先在离心管的顶部用针戳一个洞，然后用收集DNA的针—针筒直接在DNA条带的下方，插入离心管壁，取出DNA。

（8）以氯化铯饱和的水相平衡异丙醇，再用异丙醇反复抽提收集的DNA，以去除溴化乙啶。

（9）向DNA的溶液中加入2倍体积的水和6倍体积的乙醇，混匀，-20℃孵育1h。4℃下以8000r/min（7500×g）的速度离心10min。DNA立即沉淀成为单一白色的块。这DNA可用顶端带有钩的巴斯德吸管收集，也可用简单的离心来收集。

（10）将沉淀物重新混悬在TE缓冲液中，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠和2倍体积的乙醇以再沉淀。如果看不见沉淀，在-20℃下孵育2h，离心收集DNA。

（11）将最后的沉淀在空气中干燥，重新溶解在TE缓冲液中。

实验三　人外周血白细胞DNA提取

【实验原理】

本法采用血液/组织/细胞基因组提取试剂盒（DP304），从全血中分离白膜层，去除其中的红细胞及蛋白质，裂解白细胞释放DNA，再通过去除DNA中的杂质使其纯化，得到高纯度的DNA原液，最后使用微量紫外可见分光光度计对DNA的浓度及纯度进行定量检测。

【实验材料及试剂】

1.实验材料：1.5mlEP管、微量移液器（10μL、50μL、200μL、1000μL）、涡旋振荡器、数显恒温搅拌循环水箱、吸附柱、收集管、离心机、涡旋振荡器、微量紫外可见分光光度计（Thermo NanoDrop1000）。

2.实验试剂：正常人混合血液（应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降）、红细胞裂解液（裂解红细胞）、缓冲液GA（轻微裂解作用，为蛋白激酶K提供反应环境，若溶液产生沉淀，使用前应在37℃水浴中预热10min，以溶解沉淀）、蛋白激酶K（裂解蛋白质）、缓冲液GB（裂解白细胞，释放DNA，若溶液产生沉淀，使用前应在37℃水浴中预热10min，以溶解沉淀）、无水乙醇（沉淀DNA，去除杂质）、缓冲液GD（去除蛋白质，使用前应按照试剂瓶标签的说明加入无水乙醇）、缓冲液PW（去除盐，使用前应按照试剂瓶标签的说明加入无水乙醇）、洗脱缓冲液TE（保存DNA）。

【实验步骤】

1.样品的采集与保存：用装有EDTA的塑料管采集2mL静脉血，2000rpm离心5min，可见分层，分别为血浆层、白膜层、红细胞，将血浆吸出弃去，再通过点吸的方式将白膜层全部吸出，置于干净的1.5mL EP管备用。如无法及时提取DNA，则应置于-80℃进行保存。

2.样品预处理

（1）裂解红细胞：通过低速涡旋15s混匀样品，取150μL样品置于干净的1.5mL EP管，加入750μL红细胞裂解液，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀5min，然后10000rpm离心2min，吸去上清，留下白细胞沉淀。

（2）重悬白细胞：加入200μL缓冲液GA，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀3～5min，使白细胞沉淀重悬。

（3）裂解蛋白质：加入20μL蛋白激酶K，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀1min。

（4）裂解白细胞，释放DNA：加入200μL缓冲液GB，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀10min，70℃水浴10min。

（5）沉淀DNA，去除杂质：加入200μL无水乙醇，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀15s，简短离心使样品进一步混匀并去除管盖内壁的水珠。将管内所有溶液都加入吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

（6）去除蛋白质：向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

（7）去除盐类：向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

（8）去除盐类：重复步骤（7）。向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

（9）去除残存漂洗液：将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3打开盖子置于室温放置10min。

（10）洗脱DNA：将吸附柱CB3转入一个干净的1.5mL EP中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液 TE，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到1.5mL EP管中，如无法及时测定，应置于-80℃进行保存。

（11）测定DNA浓度及纯度：使用微量紫外可见分光光度计进行测定，测定前通过手弹EP管底部3～5次的方式来使DNA溶液混匀。

【实验结果分析】

（1）A230nm：碳水化合物和盐类最高吸收峰吸收波长。

（2）A280nm：蛋白质及酚类物质最高吸收峰吸收波长。

（3）A260nm：DNA/RNA最高吸收峰吸收波长。

（4）260/280：比值应在1.8～2.0之间，低于1.8表示有蛋白质及酚类物质污染，高于2.0表示有RNA污染。

（5）260/230：比值应大于1，低于1表示有碳水化合物和盐类污染。

（6）ng/μL：样品浓度单位，是通过样品在260nm处的吸光值以及选择的分析常数来计算的。采用本法提取的DNA溶液浓度应大于100ng/μL。