分子生物学实验注意事项：细菌处理和DNA配置技巧

（1）大质粒（大于15 kb）容易受损，故应采用温和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进行处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。

（2）可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂中，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。

（3）一些大肠杆菌菌株（如HB101的一些变种衍生株）用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时，它们会惹出麻烦：糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一条致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。故从诸如HB101和TG1等大肠杆菌菌株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。(www.xing528.com)

（4）当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株（endA+株，如HB101）中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育（如用限制酶消化）时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤（用酚-氯仿进行抽提）可以避免此问题。

（5）很多工程菌中质粒的拷贝数都非常高，以至于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，氯霉素并不是只能增加质粒DNA的产量，还能降低细菌细胞在大量制备溶液中所占体积。大量高度黏稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。