【摘要】:50mL 10 g/L变性琼脂糖凝胶:10倍电泳缓冲液5mL,琼脂糖0.5 g,0.1%DEPC水36.5mL,加热溶化,稍冷却,加入8.5mL 37%甲醛。
1.制备凝胶(1.0%)
称取0.30 g琼脂糖,加30mL×TAE电泳缓冲液,微波炉加热熔化,注意观察,勿使沸腾的琼脂糖溢出容器外。稍冷却后加入适量荧光染料混匀,倒入制胶托盘内,插好样品梳,水平放置,待琼脂糖溶液凝固。
2.准备样品
将制备的RNA样品定量,依据RNA溶液的浓度,取适量的RNA(如3μL)并用水补充至一定体积(如10μL),然后加入6倍上样缓冲液(如2μL),混匀,放置在冰上待用。
3.上样
将载有琼脂糖凝胶的制胶托盘放置于电泳槽内,加入电泳缓冲液浸过凝胶上表层,然后将样品点入上样孔。以60~80 V的电压电泳约30min。如条件允许应进行电泳缓冲液循环,否则,在一定时间(如10min)将两极附近的缓冲液调换混匀,以防止一侧过热而出现RNA降解。待溴酚蓝迁移至凝胶长度的2/3~4/5处结束电泳。
4.在凝胶成像系统观察并分析(www.xing528.com)
RNA的变性琼脂糖凝胶电泳与DNA的操作相同。使用的主要试剂如下。
(1)0.1%DEPC水:200mL双蒸去离子水加0.2mLDEPC(焦碳酸二乙酯),充分搅拌混匀,室温放置过夜,高压灭菌。
(2)10倍电泳缓冲液:吗啉代丙烷磺酸(MOPS)0.4mol/L(pH值为7.0),NaAc 0.1 mol/L,乙二胺四乙酸(EDTA)10mmol/L。
(3)50mL 10 g/L变性琼脂糖凝胶:10倍电泳缓冲液5mL,琼脂糖0.5 g,0.1%DEPC水36.5mL,加热溶化,稍冷却,加入8.5mL 37%甲醛。
(4)上样缓冲液:50%甘油,1mmol/LEDTA,4 g/L溴酚蓝,40 g/L二甲苯蓝。
(5)去离子甲酰胺。
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