分子生物学实验：无变性电泳和测定RNA相对分子质量的方法

带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。核酸分子是两性解离分子，在pH值为3.5时碱基上的氨基基团解离，而三个磷酸基团中只有第一个磷酸解离，整个分子带正电荷，在电场中向负极泳动；在pH值为8.0～8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动。不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。如采用适宜浓度的凝胶介质作为电泳支持物，其特有的分子筛效应，就可以使不同大小和构象的核酸分子泳动速率出现较大差异，从而达到分离的目的。因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，还取决于分子大小、凝胶的浓度与孔径。

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法，常用于核酸的电泳分离，可分离相差100 bp的DNA片段。RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%～1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分离，但无法判断其相对分子质量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与相对分子质量的对数呈线性关系。因此要测定RNA相对分子质量时，一定要用变性凝胶。如需快速检测提取总RNA的质量，可用普通的1%（10 g/L）琼脂糖凝胶观察，确认所提RNA的质量。

核酸经过染色才能显示带型，最常用的是溴乙锭染色法。溴乙锭（EB）是一种荧光染料，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。激发荧光的能量来源于两个方面，一是核酸吸收波长为260 nm的紫外线后能将能量传递给溴乙锭，二是结合在DNA分子中的EB本身，主要吸收波长为300 nm和360 nm的紫外线的能量，来源于这两方面的能量，最终激发EB发射出波长为590 nm的可见光谱红橙区的红色荧光。EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离于凝胶中的EB本身发出的荧光强大10倍，因此不需要洗净背景就能清楚地观察到核酸的电泳带型。(www.xing528.com)

完整的未降解的RNA制品的电泳图谱，应可清晰地看到28 S rRNA、18 S rRNA、5 S rRNA i条带，且28 S rRNA的亮度应为18 S rRNA的两倍。本实验采用在非变性条件下快速检测RNA的电泳方法。