RNA抽提纯化是分子生物学研究的基本实验手段之一。虽然Trizol试剂和各类RNA抽提纯化试剂盒的广泛应用使得RNA抽提和纯化不再特别困难,但由于RNA酶的广泛存在和难以灭活的性质,还是使得RNA的抽提纯化和后续工作有一定的难度。
RNA酶的污染主要有外源RNA酶的污染与内源RNA酶的污染两方面。包括试剂、器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统,还包括抑制剂失效或者用量不够、实验样品过多造成交叉污染等。
为严格控制实验条件,避免任何可能的污染,必须做到以下几点。
(1)实验室应专门辟出RNA操作区,离心机、移液器、试剂等应专用。RNA操作区应保持清洁,并定期进行除菌。
(2)尽可能在超净台中按照细胞培养的要求进行操作,有效避免操作中引起的RNA酶污染。
(3)操作过程中应始终戴一次性乳胶手套,并经常更换,以防止手、手臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用具。因一次性塑料手套无弹性,操作不便,应尽量避免使用。
(4)唾液中含RNA酶,因此避免在操作中说话、聊天,也可以戴口罩以防止引起RNA酶污染。(www.xing528.com)
(5)尽量使用一次性的塑料制品,尽量避免共用器具如滤纸、吸头、离心管等,以防交叉污染。
(6)建议使用厂家供应的出厂前已经灭菌无RNA酶的吸头和离心管等。目前多数厂家供应的无菌塑料制品很少有RNA酶污染,买来后可直接用于RNA操作。
(7)配制溶液用的酒精、异丙醇、Tris等应采用未开封的新试剂。
(8)无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干次,这样通常可以消除RNA酶的活性,但氯仿会溶解某些塑料制品,应当注意。
(9)RNase AwayTM试剂可以替代DEPC,操作简单、价格低且无毒性。只需将RNase AwayTM直接倒在玻璃器皿和塑料器皿的表面,浸泡后用水冲洗去除,即可以快速去除器皿表面的RNA酶,并且不会残留而干扰后续实验。
(10)RNA酶污染的大致来源或过程有:①手指头;②枪头;③水/缓冲液;④实验台面;⑤内源RNA酶;⑥RNA样品;⑦质粒抽提;⑧RNA保存;⑨后续实验所用的酶。
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