莱州湾人工海岸生态化建设技术：大叶藻繁育与种群恢复

海草床是近岸海域重要的初级生产者也是重要的浅海生态系统之一，具有极其重要的生态价值和经济价值。在近岸生态系统中海草床在稳定底质、净化水体、固碳和营养物质循环等方面具有至关重要的作用；海草床是众多生物潜在的生境和食物来源以及庇护和育幼场所。近年来由于自然条件变迁和人为活动干扰，世界范围内几乎所有的海草床都处于衰退中。因此，开展受损海草床的修复，对恢复、重建海底植被，改善渔业生态环境具有积极而重要的作用。大叶藻（Zostera marina L.）是海草的一种，为大叶藻科、大叶藻属的单子叶海洋高等植物。大叶藻在我国主要分布于河北、辽宁和山东省等海域，是北方海域海草的优势种。历史上我国大叶藻资源十分丰富，威海地区的渔民曾使用大叶藻的叶子作为屋顶材料，然而近些年来受人类活动加剧的影响，大叶藻资源急剧衰退。

大叶藻的种植技术涉及海域条件、本底调查、种子、种子运输、种子计数、种子播种、保护与监测、效果评价等技术要求，系统性、技术性要求较高，至今国家或是地方仍缺乏统一的技术规范。目前建立的大叶藻种植技术体系，为大叶藻的生态修复打下了坚实基础。该大叶藻培植、扩繁与群落构建技术仅针对人工岸段，对其他海域不具有普适性。

（一）大叶藻组织培养的研究

本研究不同于以往的大叶藻组织培养的研究在于，在将大叶藻外植体消毒处理后，不是直接切成小块接入激素培养基中诱导愈伤组织，而是将长度4～5 cm的茎部作为外植体直接接入基本培养基中培养，在确定其有生长能力且无染菌情况出现，即成为无菌苗之后，再切成小块接入含激素的培养基中进行愈伤组织的诱导。这种方式，一方面可以缓解外植体因强烈的消毒作用再加上切割所带来的过度伤害，提高大叶藻外植体的活力及大叶藻愈伤组织的诱导率，另一方面，可以解决因染菌所导致的外植体死亡的问题，保证大叶藻的组织培养能在无菌的环境下顺利进行。

大叶藻是一种沉水高等植物，长期生活在海水环境中，根和地下茎被含有丰富多样的微生物的泥沙包围，大叶藻茎部的每个茎节都有须根的生长，须根间的间隙常常寄生着多种大量的微生物，这是这种不规则的外植体形状，使其消毒处理难以彻底进行，而且大叶藻植株的根茎叶内都有大量的气道，气道内存在着内生菌，表面消毒无法实验外植体完全无菌的要求，而外植体染菌后迅速死亡，直接导致实验失败。所以，为外植体创造出无菌的生长条件成为大叶藻组织培养最为重要也是首先需要解决的难题。

1.消毒剂的种类、浓度及消毒时间的研究

（1）实验材料与试剂：大叶藻植株采自威海荣成海域。

消毒剂为0.1%氯化汞，0.2%氯化汞，1%次氯酸钠，3%次氯酸钠，0.1%新洁尔灭，0.2%新洁尔灭，75%酒精。

（2）实验方法：先将大叶藻进行预处理。取大叶藻茎部分，剪成6～8 cm的长度，并除去茎节上的所有须根，用安利洗洁精以1∶1 000比例混合的溶液清洗干净，除去所带泥沙及附着在其表面的微藻等生物，自来水清洗4次。

将预处理后的大叶藻茎转移到超净工作台中，先用75%的酒精溶液处理外植体15 s，再按照不同消毒剂的种类、浓度及消毒时间进行处理，再用无菌海水冲洗5次，最后将外植体的两端切除防止消毒剂残留在外植体内。本实验共选取3种消毒剂，每种消毒剂2种浓度，每种浓度分3种时间进行处理，共18组不同的处理，每组24瓶，每瓶接1外植体。

培养基为PES培养基，蔗糖浓度3%，pH 8.0，培养温度15℃±2℃，光照为自然光源。20天后统计染菌率。

（3）实验结果：次氯酸钠与新洁尔灭两种消毒剂在处理时间为8 min和16 min的8组处理的外植体，在2周后全部染菌，20天后，次氯酸钠与新洁尔灭两种消毒剂的所有处理组中除3%次氯酸钠32 min处理组有2瓶外植体未染菌外，其余全部染菌。氯化汞各处理组中均有未染菌的外植体，且随氯化汞浓度的增大及消毒处理时间的增加，外植体的染菌率呈下降的趋势，细菌污染状况见图8-88。同时，外植体均有不同程度的褐变现象。具体如表8-55所示。

表8-55　消毒剂的种类、浓度及消毒时间对大叶藻外植体的影响

续　表

图8-88　细菌污染状况

（4）讨论：从实验结果来看，不同的消毒剂的种类、浓度及作用时间对大叶藻外植体的消毒效果相差较大。

从染菌率上来看，1%次氯酸钠、3%次氯酸钠、0.1%新洁尔灭及0.2%新洁尔灭8 min、16 min及32 min的处理组几乎全部染菌。从染菌现象出现的时间来看，1%次氯酸钠及0.1%新洁尔灭8 min的处理组最先出现明显的染菌现象，20天后染菌现象非常严重；3%次氯酸钠及0.2%新洁尔灭8 min的处理组，1%次氯酸钠、3%次氯酸钠、0.1%新洁尔灭及0.2%新洁尔灭16 min的处理组，1%次氯酸钠及0.2%新洁尔灭32 min的处理组先后在相近的时间出现明显的染菌现象；3%次氯酸钠及0.2%新洁尔灭在32 min的处理组最后出现明显的染菌现象，但是由于外植体长时间在消毒剂中的浸泡，受到较大的伤害，处理后都有明显的褐变现象，3%次氯酸钠在处理32 min后，虽然有2瓶未染菌，但是由于次氯酸钠浓度过高，氧化性强，对外植体有强烈的氧化作用，致使褐变现象严重，外植体无生长现象，最后死亡。

在氯化汞处理的6组中，均有未出现染菌现象的外植体，随着消毒浓度的增大和处理时间的增加，染菌率均有下降的趋势，最低的染菌率为0.2%氯化汞32 min的处理组的54.17%，且出现明显的染菌现象的时间都较晚。0.1%氯化汞及0.2%氯化汞8 min处理组的染菌率差别较小，但是这2组外植体相比较，0.2%氯化汞8 min处理组的外植体褐变现象较严重，无生长现象，而0.1%氯化汞8 min处理组的部分外植体茎尖部分有新绿叶长出，生长状况较前一组好。氯化汞的处理时间为16 min及32 min时，由于氯化汞的剧毒性，过长的消毒时间，使外植体在灭菌的同时也遭受到了严重的损伤，甚至导致外植体的死亡，经过长时间氯化汞处理后的外植体褐变现象十分严重，整个外植体呈深棕色，最后死亡。

总的来比较，3%次氯酸钠32 min处理及氯化汞的各个处理组对灭菌都有一定的效果，但是3%次氯酸钠在处理32 min后由于浓度过大，外植体损害严重，不能维持其活性，所以不适宜选作消毒剂，而氯化汞的各组处理中，除0.1%氯化汞8 min的处理组外，其余5组都会对外植体造成过大的伤害，导致外植体褐变死亡，所以，所有处理组相比较，最适合的消毒方式为用0.1%氯化汞消毒8 min。

虽然如此，但是这种方式依然有很高的染菌率，而且由于氯化汞的剧毒性，通过增大浓度或延长消毒时间来降低染菌率是不可取的，大叶藻外植体表面不规则的形状使得短时间的表面消毒的无法得到完全无菌的外植体，必须通过其他的消毒方式来加以补充，所以，需要选择一种温和的、对外植体没有毒害作用或者毒害作用尽可能小的辅助消毒剂进行较长时间的辅助消毒，更全面彻底地将外植体表面的各个部分进行消毒。

2.辅助消毒剂的种类、浓度、消毒时间的研究

（1）实验材料与试剂：大叶藻植株采自威海荣成海域。

消毒剂为75%酒精溶液，0.1%氯化汞溶液。辅助消毒剂为1%碘伏，0.01%溴氯海因，0.05%溴氯海因，0.1%溴氯海因。

（2）实验方法：先将大叶藻进行预处理。取大叶藻茎部分，剪成6～8 cm的长度，并除去茎节上的所有须根，用安利洗洁精以1∶1 000比例混合的溶液清洗干净，除去所带泥沙及附着在其表面的微藻等生物，自来水清洗4次。

将预处理后的大叶藻茎转移到超净工作台中，先用75%的酒精溶液处理外植体15 s，再用0.1%的氯化汞处理外植体8 min，无菌海水冲洗3次，最后按照不同辅助消毒剂的种类、浓度及消毒时间进行处理，再用无菌海水冲洗5次，最后将外植体的两端切除防止消毒剂残留在外植体内。本实验共选取2种辅助消毒剂：碘伏浓度为1%，分5种消毒时间进行处理；溴氯海因为3种浓度，每种浓度分2种消毒时间处理。共11组不同的处理，每组24瓶，每瓶接1外植体。

培养基为PES培养基，蔗糖浓度3%，pH 8.0，培养温度15℃±2℃，光照为自然光源。20天后统计染菌率。

（3）实验结果：溴氯海因的各处理组都在相近的时间开始出现明显的染菌现象，不同浓度及不同处理时间的溴氯海因处理组的染菌率都很高且之间无明显差异，与单独只有氯化汞的处理相比，也没有明显差异。碘伏处理1 h及以上的各组出现明显染菌现象的时间较相近，处理0.5 h的处理组较早出现明显的染菌现象，见图8-89。具体如表8-56所示。

图8-89　霉菌污染状况

表8-56　辅助消毒剂的种类、浓度、消毒时间对大叶藻外植体的影响

（4）讨论：溴氯海因与次氯酸钠类似，通过次氯酸及次溴酸发生氧化反应达到消毒的目的，所以即使浓度较低，作用的时间也不宜过长，否则会对外植体有强烈的损伤，通过表8-56，可以看出，不同浓度及消毒时间的溴氯海因处理组之间的消毒效果无明显差异，染菌率都在90%以上，无明显的消毒效果，不能作为辅助消毒剂进行消毒作用。

碘伏选取的是常用的医用碘伏，浓度为1%，这种浓度的碘伏可直接涂于皮肤进行消毒，是较温和的广谱消毒剂，可以进行较长时间的消毒，但是6 h以后处理的外植体会发生较明显的褐变现象，处理时间为12 h时，外植体甚至出现脱水的情况，说明碘伏处理的时间不宜超过6 h，而处理时间为1～12 h的各组的染菌率较相似，均在70%左右，所以1%碘伏1 h的处理可以确定为所有处理组中最合适的消毒方式。

虽然如此，染菌率依然较高，辅助消毒剂只将染菌率从90%左右下降到70%左右，依然无法彻底地进行灭菌。易染菌的位置位于外植体的两端，经过实验排除实验工具如手术刀等及实验操作方面的污染的可能，且通过观察染菌的菌落形态等特征，并通过显微镜观察培养基中的微生物形态发现，污染的微生物无真菌，全部为细菌，且主要生长的细菌类型大概可分为5～7种，由于大叶藻植株体内有大量的气道存在，推断可能存在内生菌，消毒剂无法对内生菌进行消毒，而将外植体两端切除多余部分后，内生菌可能与培养基接触，从而发生污染现象。所以，仅仅表面消毒是不够的，需要选择持久作用的灭菌方式来达到灭菌的目的。将抗生素加入培养基中，可以进行长期的灭菌作用，但是抗生素的使用对外植体的生长也会有不同程度的影响，因此，必须对加入培养基的抗生素的种类和有效最小抑菌浓度加以探索研究。

3.抗生素对污染的抑制作用的研究

（1）抗生素种类的筛选：

① 实验材料及试剂：从所有的染菌的培养瓶中，尽可能全面的挑出所有类型的菌群，接入6瓶LB液体培养基，放入摇床以150 r/min，20℃自然光照，培养24 h，制成菌液待用。

选取四种常见抗生素：1%氨苄青霉素溶液、1%硫酸新霉素溶液、1%卡那霉素溶液、1%链霉素溶液。培养基为LB液体培养基及含5%琼脂的LB固体培养基制成的平板。

② 实验方法：从培养好的6瓶菌液中分别取50μL滴在分别加入氨苄青霉素、硫酸新霉素、卡那霉素、链霉素的平板的特定位置上，均匀涂布后，做好标记，每种类型3次平行样，20℃自然光照，培养48 h，观察结果，筛选出抑菌效果明显的抗生素种类。

③ 实验结果：在抗生素种类筛选的实验中，如图8-90～图8-93所示，含有氨苄青霉素及链霉素的平板中有明显的菌落的形成，表明，氨苄青霉素对3号及6号菌群不能进行有效地抑制，链霉素对1号菌群不能进行有效地抑制。而在含有硫酸新霉素与卡那霉素的平板中均没有菌落形成，抑菌效果明显。表明，硫酸新霉素与卡那霉素都对大叶藻组培的污染菌群有很好的抑制作用，可以选择这2种抗生素加入培养基中进行长期抑菌。

图8-90　氨苄青霉素的抑菌效果

图8-91　硫酸新霉素的抑菌效果

图8-92　卡那霉素的抑菌效果

图8-93　链霉素的抑菌效果

（2）抗生素最小抑菌浓度的筛选：

① 实验材料及试剂：从所有的染菌的培养瓶中，尽可能全面的挑出所有类型的菌群，接入6瓶LB液体培养基，放入摇床以150 r/min，20℃自然光照，培养24 h，制成菌液待用。

抗生素为1%硫酸新霉素溶液、1%卡那霉素溶液。菌液培养基为LB液体培养基。

② 实验方法：取等量菌液，分别加入浓度梯度为5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL及200μg/mL的LB液体培养基中（表8-57），20℃自然光照，培养24 h后，用紫外分光光度计测OD600值。

表8-57　抗生素最小抑菌浓度筛选时各实验组成分

③ 结果：如图8-94所示，卡那霉素与硫酸新霉素抑菌浓度曲线表明，在抗生素最小抑菌浓度的实验中，当卡那霉素浓度大于等于100μg/mL时有明显的抑菌效果，有效抑菌率为98.12%。硫酸新霉素浓度大于等于25μg/mL时有明显的抑菌效果，有效抑菌率为95.82%。

图8-94　卡那霉素与硫酸新霉素抑菌浓度曲线

④ 讨论：通过抗生素种类和浓度的筛选，最终确定100μg/mL的卡那霉素及25μg/mL的硫酸新霉素，两种抗生素共同作用。抗生素对细菌有抑制作用，但是同时对外植体也有一定的伤害，会影响其愈伤组织的诱导率，而且会引起外植体的褐变，最终导致其死亡。所以在使用抗生素的时候，必须严格控制其浓度，并且，卡那霉素和硫酸新霉素的稳定性较差，温度较高时会分解，无法进行抑菌作用，因此在配制添加了抗生素的培养基的时候，需要在培养基高温高压灭菌后，温度降到40℃以下时再加入抗生素，在培养基凝固前摇晃均匀。

抗生素加入后，大叶藻外植体的染菌率降到了33.34%，下降十分明显，说明抗生素起到了较好的抑菌作用，仍有部分外植体染菌的原因，可能是因为经过一段时间后，抗生素因其不稳定发生了分解，无法继续有效地进行抑菌，所以应该缩短转瓶的时间，10天左右就把外植体转入新的培养瓶中，且为保证抗生素有效，培养基应做到现用现配。

4.对褐变作用抑制的研究

（1）活性炭对褐变作用的影响：

① 实验材料与试剂：大叶藻植株采自威海荣成海域。

吸附剂为活性炭粉。消毒剂为75%酒精，0.5%碘伏，0.1%氯化汞。抗生素为卡那霉素，硫酸新霉素。

② 实验方法：取大叶藻茎部分，剪成6～8 cm的长度，并除去茎节上的所有须根，用安利洗洁精以1∶1 000比例混合的溶液清洗干净，除去所带泥沙及附着在其表面的微藻等生物，自来水清洗4次。在超净工作台中，按照75%酒精溶液15 s，0.5%碘伏1 h，0.1%的氯化汞8 min的顺序进行处理，再用无菌海水冲洗5次，最后将外植体的两端切除防止消毒剂残留在外植体内，分别接入活性炭含量为0、0.1%和0.3%的已加入抗生素的培养基中。共3组处理，每组30瓶，每瓶接一个外植体。

培养基为PES培养基，蔗糖浓度3%，pH8.0，培养温度15℃±2℃，光照为自然光源。10天后观察褐变情况。

③ 实验结果：没有添加活性炭的处理组所有外植体均有明显的褐变现象，20天后部分外植体死亡。添加0.1%活性炭的处理组所有外植体的褐变现象较前一组有所减轻，另外有3瓶外植体无明显褐变现象发生。添加0.3%活性炭的处理组有2瓶出现褐变现象，见图8-95，其他无明显褐变现象，具体见表8-58。

图8-95　褐变的苗端

表8-58　活性炭含量对褐变现象的影响

（2）外植体取材部位对褐变作用的影响：

① 实验材料与试剂：大叶藻植株采自威海荣成海域。(www.xing528.com)

消毒剂为75%酒精，0.5%碘伏，0.1%氯化汞。抗生素为卡那霉素，硫酸新霉素。

② 实验方法：取大叶藻茎部分，剪成6～8 cm的长度，并除去茎节上的所有须根，用安利洗洁精以1∶1 000比例混合的溶液清洗干净，除去所带泥沙及附着在其表面的微藻等生物，自来水清洗4次。在超净工作台中，按照75%酒精溶液15 s，0.5%碘伏1 h，0.1%的氯化汞8 min的顺序进行处理，再用无菌海水冲洗5次，最后将外植体分成茎尖部分和茎段部分，并将两端切除防止消毒剂残留在外植体内，接入已加入抗生素的培养基中。共2组处理，每组30瓶，每瓶接2个外植体。

培养基为PES培养基，蔗糖浓度3%，pH8.0，培养温度15℃±2℃，光照为自然光源。10天后观察褐变情况，20天后统计染菌率。

③ 实验结果：两组对比来看，外植体为大叶藻茎尖部分的处理组褐变现象比外植体为大叶藻茎段部分的处理组较轻，且发现染菌率也是前者比后者低一半左右，见表8-59。

表8-59　外植体取材位置对褐变现象的影响

（3）光照强度对褐变作用的影响：

① 实验材料与试剂：大叶藻植株采自威海荣成海域。

消毒剂为75%酒精，0.5%碘伏，0.1%氯化汞。抗生素为卡那霉素，硫酸新霉素。

② 实验方法：取大叶藻茎部分，剪成6～8 cm的长度，并除去茎节上的所有须根，用安利洗洁精以1∶1 000比例混合的溶液清洗干净，除去所带泥沙及附着在其表面的微藻等生物，自来水清洗4次。在超净工作台中，按照75%酒精溶液15 s，0.5%碘伏1 h，0.1%的氯化汞8 min的顺序进行处理，再用无菌海水冲洗5次，最后将外植体的两端切除防止消毒剂残留在外植体内，接入已加入抗生素的培养基中，分别放入3组不同光照强度的培养箱中培养。3组处理，每组30瓶，每瓶接一个外植体。

培养基为PES培养基，蔗糖浓度3%，pH 8.0，培养温度15℃±2℃，光照分别为自然光源、1 500 lx及3 000 lx。10天后观察褐变情况。

③ 实验结果：3组处理组均出现褐变现象，自然光照的处理组虽然出现较明显的褐变现象，但是与其他2组比较，褐变现象较轻，3 000 lx光照处理组褐变现象最严重，且已有部分外植体死亡，见表8-60。

表8-60　光照强度对褐变现象的影响

④ 讨论：褐变现象与植物细胞中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有关。在多酚氧化酶的作用下，酚类物质被氧化成褐色的醌类物质，醌类物质经过一系列的作用，与植物细胞中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，抑制其他酶的活性，从而毒害整个外植体，导致植物体代谢紊乱，生长受阻，最终逐渐死亡。影响褐变现象的因素是多方面的，从实验结果来看，外植体的取材部位、光照强度及吸附剂的添加等都对褐变现象有一定的抑制作用。

褐变现象的发生与外植体的情况及培养条件都有很大的关系，对外植体自身而言，不同部位的取材，会影响褐变的情况，茎尖部分的分生能力较强，体内酚类物质的含量比茎段部分的含量低，所以褐变现象茎段部分比茎尖部分严重。另外，通过实验结果发现，茎尖的染菌率比茎段的染菌率低一半左右，可能是因为茎尖部分比茎段部分的表面要光滑和规则，消毒处理更加容易，也可能是因为茎尖部分的内生菌比茎段部分少，所以在外植体部位的选择上，应选择大叶藻茎尖部分进行处理。

在培养基中添加吸附剂吸附酚类氧化物也可以有效控制褐变，添加0.1%活性炭的培养基的处理组中褐变现象比没有添加活性炭的处理组要有所缓和，添加0.3%活性炭的培养基的处理组无明显褐变现象，说明活性炭能够有效地控制褐变，不过，其吸附作用并无选择性，在吸附酚类物质的同时也吸附营养物质，所以在使用时要注意活性炭添加的浓度。组织培养的光照强度也对褐变现象有一定的影响，自然光照下大叶藻外植体出现褐变现象，当外加光照强度为1 500 lx时，褐变现象更加严重，当外加光照强度增加到3 000 lx时，褐变现象十分严重，外植体因为过多的酚类物质的积累作用直接死亡。所以，为了控制褐变，应在培养基中添加0.3%活性炭，培养光照条件为自然光源（图8-96）。

图8-96　正常生长的大叶藻无菌外植体

5.激素的种类、浓度及组合对诱导愈伤组织的研究

（1）实验材料与试剂：正常生长的大叶藻无菌外植体。

消毒剂为75%酒精，0.5%碘伏，0.1%氯化汞。抗生素为卡那霉素，硫酸新霉素。激素为2，4-D和6-BA。吸附剂为活性炭粉。

（2）实验方法：将之前实验中，正常生长的大叶藻无菌外植体切成3 mm×3 mm的形状，接入添加了不同种类、浓度及组合激素的培养基，进行愈伤组织的诱导，共16组处理，每组20瓶，每瓶接5块。

培养基为PES培养基，蔗糖浓度3%，pH 8.0，培养温度15℃±2℃，光照为自然光源。10天后观察褐变情况，20天后统计染菌率。

（3）实验结果：所有处理组中的外植体组织，几乎无明显愈伤组织的形成，部分有明显的褐变现象，部分直接坏死，部分无生长情况也无坏死迹象，见表8-61。

表8-61　不同浓度及组合激素对愈伤组织诱导的影响

（4）讨论：2，4-D与6-BA是两种常用的愈伤组织诱导激素，能够高效的诱导多种植物的愈伤组织，且这两种激素的联合作用比单独作用的效果更好。但在本次实验中，不同浓度的2，4-D与6-BA的配比组合都没有成功诱导愈伤组织，与马欣荣的实验结果相同，但由于其外植体全部因染菌死亡，因而其愈伤组织没有形成的原因也有可能是因为染菌而非激素作用无效果。于函（2007）的实验结果中，有愈伤组织的形成，不同浓度的2，4-D与6-BA的组合对愈伤组织的诱导率及质量较大的影响，2，4-D浓度为2 mg/L、6-BA浓度为1 mg/L时，愈伤组织的诱导率最高，为18.7%，且过高浓度的激素对愈伤组织的形成有抑制作用。

本研究中，含有2，4-D与6-BA的不同浓度和配比的激素培养没有成功诱导大叶藻的愈伤组织，并出现褐变及坏死的情况，原因可能为以下三方面：首先，是实验所选择的激素种类及浓度的配比不适合诱导愈伤组织，近年来海洋植物的组织培养研究较少的原因之一就是对其生长发育所需的激素的类型不能确定，可能大叶藻细胞内不存在2，4-D及6-BA两种生长激素的受体，这两种激素对大叶藻的生长没有任何作用，也可能这两种激素能够对大叶藻的生理产生作用的浓度的不同于陆生植物的一般要求，实验中的浓度及配比并不符合大叶藻愈伤组织诱导的需要，所以诱导愈伤组织失败。其次，为使外植体灭菌彻底，保证外植体能在无菌的环境中正常生长发育，添加了两种抗生素进行长期的抑菌作用，但是抗生素对细菌生长起抑制作用的同时对植物组织也有一定的毒害作用，正是抗生素的这种作用使得愈伤组织不能形成。第三，褐变现象的发生，由于外植体体内的酚类物质被多酚氧化酶氧化，并进一步与组织中的蛋白质发生聚合，抑制其他酶的活性，影响了大叶藻组织细胞的正常的生长发育，进而毒害整个外植体组织，最终导致死亡。

所以，针对以上三种可能的原因，在以后的愈伤组织诱导实验中，可从以下三方面进行尝试：选用其他种类和浓度的激素组合配比的培养基；在无菌苗培养一段时间确认能够正常生长之后，切段转入添加诱导愈伤组织的培养基时，培养基不再加入抗生素；利用多种手段，如添加吸附剂、降低光照强度等方式，抑制褐变现象的发生，保证外植体的正常生长。

6.总结

本研究以大叶藻茎部作为外植体，进行组织培养，研究的重点主要集中在灭菌方法的方面，其次对控制褐变作用及诱导愈伤组织的激素方面也做了一些探讨，结论如下：

（1）最佳的消毒方式为在用洗洁精溶液预处理除去所带泥沙及附着在其表面的微藻等生物后，按照75%酒精处理15 s，0.5%碘伏处理1h，0.1%氯化汞处理8 min的顺序进行消毒处理。

（2）为了保证外置体能够在无菌环境正常生长，培养基中需加入100μg/mL的卡那霉素及25μg/mL的硫酸新霉素，进行长期的抑菌作用。

（3）在外植体部位的选择方面，茎尖部分比茎段部分的染菌率低一半左右，更适合作为组织培养的外植体。

（4）对于褐变作用的抑制，加入0.3%活性炭，减少光照强度，选择茎尖部分作为外植体等方式，都是较有效的手段。

（5）具体的从愈伤组织到幼苗过程的研究还需要进一步工作，大叶藻组织培养技术体系的构建还有很长一段路要走。

（二）大叶藻扩繁与群落构建技术

大叶藻种群的恢复与构建，需因地制宜，采用分区域多手段恢复的模式进行恢复和构建。

1.捆绑固定恢复

对于潮汐流速较大的区域，采用成体捆绑固定的方式进行恢复（图8-97、图8-98）。

图8-97　大叶藻成体捆绑

图8-98　大叶藻成体固定

2.直接种植成体

对于潮汐流速较小的区域，采用直接种植成体的方式进行恢复（图8-99、图8-100）。

图8-99　大叶藻成体种植

图8-100　大叶藻成体种植现场

3.大叶藻匍匐茎种植

在潮汐流速较小的区域，也可采用直接种植成体的方式进行恢复（图8-101，图8-102）

图8-101　大叶藻匍匐茎种植

图8-102　大叶藻匍匐茎种植现场

4.大叶藻种子种植

（1）播种的海域环境：大叶藻种子播种水域应符合下述基本条件：水质符合GB 11607的规定；水域生态环境良好，透明度高，水流畅通、平缓，受大风大浪影响小，温度、盐度等水质因子适宜；水域高潮时水深在1～2 m；非倾废区，非盐场、电厂、养殖场等进、排水区；底质适宜，底质表层为泥沙质；水域底栖生物和大型藻类少。

（2）种子的采集和保存：种子的采集一般在7月中下旬进行。采集时，只采集种子已成熟的生殖枝。将采集的生殖枝倒入塑料容器中，搅拌，过滤，获得成熟的种子。移入盛有正常盐度海水的玻璃容器中，海水水质符合GB 11607要求，于4℃、黑暗环境下保存。期间，每5～7天搅拌种子、更换海水一次。

（3）种子的质量要求：待播种的大叶藻的种子质量应符合如下要求：种皮坚硬、橄榄色到棕黑色或者黑色；矩圆形、规格整齐、外观完整、纵肋清晰；前期的大叶藻种子质量监测中死亡率、致畸率之和应小于10%。

（4）种子的运输：将种子装入盛有正常盐度海水的广口瓶中，种子装入量不超过瓶容积的一半，海水满瓶，密封。气温不超过25℃时，常温运输，运时尽量控制在8 h以内，途中避免阳光暴晒。气温超过25℃时，途中应采取控温措施，运时尽量控制在5 h以内。运到播种海域后，应立即将种子移入泡沫箱等大型容器中，更换海水。

（5）种子的计数：大叶藻种子的计数采用抽样称重法，参照SC/T 2039进行。种子运输至播种水域后，从每个装有种子的瓶中随机抽样三次，将每次抽样种子沥水至不连续滴水为止称其重量，最低抽样重量不低于2.5 g。通过对抽样种子逐一计数求出三次抽样的平均单位重量种子的数量，再根据每瓶种子总重量（种子沥水至不连续滴水为止称其总重量），求得每瓶种子总数量。最后将每瓶种子总数量相加，求得播种种子总数量。

（6）种子的播种条件：种子的播种日期一般在10月份进行，并根据播种水域环境条件和保护管理措施确定具体播种日期。种子播种的气象条件一般选择晴朗、多云或阴天进行，最大风力最好在三级以下，防止大叶藻种子被风吹走。

（7）种子的播种方法：种子播种采用网袋法。播种密度：普通规格（90 cm×120 cm）麻袋的播种密度在300～400粒/袋，小规格（150 mm×100 mm，双层）棉纱布袋在20～30粒/袋。将种子放入采自播种水域的底泥或与播种水域底泥性质类似的泥沙中（每袋底泥或泥沙的使用量为装入麻袋或小规格棉纱布袋后平铺时厚度不超过5 cm为宜），混匀，装入麻袋或自制的小规格棉纱布袋，棉线封口。然后将装有种子和底泥的袋子船运至播种水域，抛锚固定船位，顺风缓慢将袋子放入播种水域，平铺海底。麻袋以20个为一个单元，小规格棉纱布袋以50个为一个单元，在一个单元内用U型铁丝将袋子相互固定，形成平铺地毯式播种单元。播种过程中时间应该控制在5 h内完成，不能完成时，应分批播种（图8-103，图8-104）。

图8-103　大叶藻种子种植

图8-104　大叶藻幼苗种植

播种过程中应做好播种记录，测量并记录播种区水深、表层水温、盐度等参数，根据当地当日气象预报情况记录天气、风向和风力，并填写种子播种记录表。

（8）种子的保护与监测：播种完成后要做好种子的保护与监测工作。种子播种保护措施主要包括：种子播种前，对播种水域妨碍种子播种的作业网具进行清理；种子播种后，对播种水域组织巡查，防止捕捞作业和采贝等渔业活动。

（9）后期的播种效果评价：种子播种后7个月，进行种子萌发和幼苗发生的抽检和评价，计算种子萌发率和幼苗发生率，编写种子播种效果评价报告。种子播种后10个月，进行植株的抽检和评价，编写植株生长评价报告。评价内容应包括植株密度、植被盖度、生长情况及其形成的生态效果等。

根据任务要求，研究区大叶藻种群恢复与构建面积100亩（约66 600 m2），生物量提高10%。综上所述，本项目完成大叶藻恢复与构建102亩（＞100亩），区域内大叶藻种群生物量显著提高（＞15%），完成了大叶藻种群恢复与构建项目预期任务目标。