百年果蝇，基因编辑技术助推科研突破

基因编辑技术的快速发展，为推动科研领域的重大突破提供了重要技术支持。

最开始是通过X射线等高能粒子或者EMS、ENU等化学诱变剂进行基因突变，之后依赖于转座子的随机突变开始出现。尽管这2种正向遗传学的突变方式，都可以引起基因突变，但因为是随机突变，且可能出现多个位点突变，后续的鉴定工作异常繁琐。

此后出现的锌指核酸酶（ZNF）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）基因编辑技术，虽然具有了靶向性，而且提高了基因编辑的效率，但需要体外构建针对靶标基因的模块化识别蛋白质以及进行体外转录，步骤繁琐，成本较高。

近几年，CRISPR/Cas9基因编辑技术被广泛应用，真正实现了简便、特异、高效、经济的基因编辑，对于推动基础研究的发展，起着至关重要的作用。

CRISPR/Cas9系统是细菌和古细菌中一种重要的获得性免疫系统，用以抵御外源DNA的入侵。当外源病毒或质粒DNA入侵时，细菌中的CRISPR/Cas9系统会启动，识别外源序列，并将其整合到CRISPR的重复单元之间。随后CRISPR序列会转录产生前体crRNA（pre-crRNA）并被加工成crRNA（small CRISPR RNA，crRNA，CRISPR相关RNA），具有导向Cas9的作用，同时Cas9蛋白也会表达。最后，crRNA与Cas9蛋白组装形成复合体，对外源入侵的病毒或者质粒进行切割，起到防御入侵的作用。

在免疫过程中，tracrRNA（trans-activating crRNA，反式激活crRNA）对于前体crRNA的加工成熟和靶标位点的识别至关重要。在使用CRISPR/Cas9的过程中，通常将携带靶标序列的crRNA和tracrRNA融合为sgRNA（single guide RNA，单链引导RNA），引导Cas9蛋白到达靶标区域，行使核酸酶功能，切割DNA分子。所以，CRISPR/Cas9系统主要由Cas9和sgRNA两部分组成。

CRISPR/Cas9系统剪接的特异性，是由位于sgRNA 5′端的20个核苷酸的靶标序列，以及位于这个靶标序列旁边叫作PAM（protospacer-adjacent motif，前间区序列邻近基序）的序列共同决定的。PAM通常是核苷酸NGG。Cas9切割后，会形成DNA上的双链断裂（double-strand break,DSB）。DSB会促使细胞进行非同源重组的末端连接（non-homologous end joining,NHEJ）。这一不精确的DNA修复方式，往往会导致小片段的插入或缺失，最终改变基因的编码区，并破坏基因的功能。(www.xing528.com)

当在切割过程中提供修复供体（donor）作为修复模板时，修复过程可成为得到精确同源重组指导的修复（homology-directed repair,HDR）。在此过程中，可以实现特定目的基因片段的插入、缺失，甚至单个核苷酸的点突变等。

CRISPR/Cas9系统被发现以后，在各种物种中利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的应用陆续被发表。在果蝇中同样出现了几种编辑方式，差别主要体现在Cas9蛋白和sgRNA的提供方式。最开始的方式是直接注射编码Cas9和sgRNA的2个质粒到果蝇的早期胚胎中，这种突变的效率比较低。第二种方式是直接注射体外转录的Cas9的mRNA和sgRNA到果蝇早期胚胎中，尽管大大提高了突变效率，但是这种方式需要体外转录，成本较高。第三种方式是分别构建Cas9和sgRNA的转基因果蝇，将两个果蝇杂交后可以得到较高的突变效率，但是这种方式在突变前和突变后都需要费时的果蝇整合。最后一种方式是构建Cas9的转基因果蝇，并利用生殖系统中特异表达的nanos启动子来驱动Cas9的表达。在这个果蝇胚胎中注射sgRNA的质粒，就可以实现高效的基因突变。Cas9只在生殖系统中表达，消除了体细胞被突变的可能性，降低了毒性。

随后优化了sgRNA的注射浓度，分析了sgRNA中GC含量对于编辑效率的影响，探究了潜在的脱靶效应，构建了果蝇全基因组水平的sgRNA在线设计数据库。可以根据sgRNA序列，预测突变效率。利用优化的方法，首次实现了一步突变4个基因，并显著提高了同源重组效率。

通过CRISPR获得的白眼黄身体果蝇（Nicolas Gompel　图）

左为全身，中为头部，右为眼睛。