RNAi技术：最理想的基因敲除方法

在研究基因功能的过程中，常用的研究手段有过表达（gain-of-function）和缺失（loss-of-function）。其中缺失通常是指将目标基因敲除，所以操作的对象可以是DNA、RNA转录的过程，RNA转录本，甚至是蛋白质，通过终止或降低目标基因的功能，来研究它们在特定生物学过程中所起到的作用。常见的方式包括CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术、CRISPR/dCas9介导的转录抑制系统、RNAi技术，以及通过小分子抑制蛋白质功能等。

尽管不同的方法都可以在一定程度上降低基因的表达量，但是从实验设计、转基因品系构建与调节效率上综合来看，RNAi技术是最理想的基因敲除技术，也是大规模筛选基因功能的理想手段。

RNAi技术自从出现开始，就得到了广泛重视和快速发展。法尔（A.Fire）和梅洛（C.Mello）发现长双链的RNA（dsRNA）可以结合与其互补的目的基因mRNA，并引发目的mRNA的降解。凭借这一发现，他们获得了2006年诺贝尔生理学或医学奖。

当dsRNA被注射到线虫或果蝇体内以后，dsRNA会被蛋白酶Dicer加工，并切割为21bp（碱基对）的siRNA。siRNA可以结合RNA诱导的沉默复合体，并通过碱基互补配对的方式与目的RNA结合，催化目的RNA的剪接降解或干扰翻译过程，实现目的基因的敲除。而如果将RNAi技术与Gal4/UAS系统结合到一起，那么就可以实现目的基因在特定发育阶段、特定组织细胞中的敲除。

果蝇体内RNAi最开始的实现方式，是直接注射dsRNA到果蝇的早期胚胎中，激发RNAi的发生。但这种方式产生一种瞬时的RNAi，只能研究目的基因早期发育阶段的功能，并且在进行大规模筛选时显得尤为费时费力。随后，通过P因子（P-element）整合并构建UAS调控的长链dsRNA，转基因果蝇的第一代转基因RNAi技术出现。利用Gal4/UAS系统，可以在特定的发育阶段、特定的组织中敲除目的基因的表达，并为构建基因组范围内针对每一个基因的转基因RNAi资源库提供路径。

此后，基因组范围的大规模筛选实验逐渐兴起，但是筛选的结果中存在较高的假阴性和假阳性。产生假阴性主要是因为载体本身以及P因子所介导的转基因整合，是随机插入基因组中的。插入的位置效应导致RNAi效率较低，而无法产生应有的表型。假阳性则来源于dsRNA的脱靶效应，以及P因子介导的随机插入对于重要基因功能的破坏。

这一问题在随后研发的第二代转基因RNAi技术中得以改善。利用phiC31介导的整合替代了P因子载体，帮助UAS—dsRNA插入固定的、可以产生高效表达的基因组位点。同时，在载体两端加上绝缘子来提高dsRNA的表达量，并降低对邻近基因的影响。

尽管第二代转基因RNAi技术已经能够实现有效的RNAi，但是dsRNA在剪接后会形成数百个siRNA，容易产生脱靶效应而造成假阳性的结果。另外，dsRNA在雌蝇生殖系统中效率很低，不能有效地调控生殖细胞内基因的表达，而雌蝇卵巢是在果蝇中开展研究的理想模型。(www.xing528.com)

在此背景下，第三代转基因RNAi技术应运而生。这一代技术继承了第二代技术的所有优点，利用UAS—shRNA取代了dsRNA，将shRNA放入microRNA的骨架中，并通过microRNA所介导的降解途径，调节目的基因的转录产物。此技术可以在体细胞和生殖细胞中实现高效的RNAi，并在一定程度上降低脱靶效应造成的假阳性。

随着大规模的应用，我们发现利用该技术构建的品系，即便没有Gal4驱动，也会在一些组织里高表达，从而影响果蝇的发育。另外，对于一些高表达的基因干扰效果有限，并且只能靶向调控一个基因，不能方便有效地调控两个及两个以上蛋白质组成的蛋白质复合物、功能冗余的基因。这些方面将是此后技术改进的重中之重。

大规模的转基因RNAi筛选，可能需要数千个UAS—RNAi果蝇品系与相应的Gal4品系杂交。现在世界上一共存在4个规模较大的转基因RNAi与Gal4的品系资源库，用以进行大规模的筛选。

维也纳果蝇资源中心（Vienna Drosophila Resource Centre,VDRC）有26 585株转基因RNAi果蝇，覆盖了果蝇中89%的蛋白质编码基因，是覆盖率最高的一个果蝇资源库。该库主要采用长链dsRNA，并利用P因子随机插入构建。

日本国家遗传学研究所（The National Institute of Genetics,NIG）的果蝇资源库包含11 910株果蝇品系，能够覆盖45%的蛋白质编码基因，也采用长链dsRNA，并利用P因子随机插入构建。

位于美国印第安纳大学的资源库（Bloomington Stock Center）和位于中国清华大学果蝇中心（TsingHua Fly Center,THFC）的资源库，都包含10 000多个果蝇品系，大约能覆盖70%的蛋白质编码基因。这2个果蝇库仍在不断扩大中，它们采取长链dsRNA和shRNA，并利用定点整合的方式，插入高表达的基因座。

4个果蝇库为以果蝇为模式生物的实验室提供着实验材料，为整个果蝇领域作出了巨大的贡献。