百年果蝇的时间加倍机制

虽然生物钟的正负调控组件都有了，负反馈环路也似乎完整了，但是仍然有一些问题，研究人员没有答案。其中一个重要的问题就是：PER和TIM蛋白为何在per和tim的mRNA生成后6～8小时，才开始在细胞质中积累？而且正因为存在从mRNA到蛋白质积累的延迟，才使得负反馈环路运行一周的时间大约为24小时（否则就只有16～18小时）。

遗传筛选发现了激酶“时间加倍”——DOUBLETIME(DBT)，使得PER蛋白的积累出现延迟。dbt为哺乳动物的酪蛋白激酶1ε（casein kinase 1ε）在果蝇内的同源基因。DBT与PER结合，磷酸化PER，并促使其降解。而TIM可以稳固由PER—DBT组成的复合体，使得DBT—PER—TIM复合体在细胞质中积累，从而拮抗DBT的效果。

此外，另外2个激酶——酪蛋白激酶2（casein kinase 2,CK2）和哺乳动物的糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β,GSK—3β），它们在果蝇内的同源基因shaggy（sgg）也作用于PER和TIM，促使其降解和进入核内。入核后，PER与DBT以及CLK—CYC形成复合体，抑制CLK—CYC对转录的激活作用，从而抑制per和tim自身的转录。在这个过程中，PER被DBT逐步磷酸化，直至PER第47位的丝氨酸（S47）被磷酸化，形成一个F-box^[2]蛋白SLIMB（即哺乳动物的β—Trcp同源基因）的结合位点。SLIMB与PER结合后，PER被泛素化修饰，并随之降解。

然而，DBT对于PER的作用，并不是简单地磷酸化而后降解，DBT作用于不同的位点有不同的效果。研究表明，NEMO激酶磷酸化PER的S596位点，从而导致其附近的位点包括S595、S593和S589被DBT磷酸化。这一系列的磷酸化，最终延迟S47位点的磷酸化，以及PER与SLIMB的结合与降解，产生延迟生物钟的效果。(www.xing528.com)

无独有偶，科诺普卡和本泽当年发现的perS正是突变了S589，导致生物钟提前，周期变短。可见，许多时候看似偶然的现象，其实隐藏着宿命般的必然。

PER在磷酸化的同时也可被去磷酸化。研究显示，蛋白质去磷酸化酶1（PP1）和蛋白质去磷酸化酶2A（PP2A）都可作用于PER，延迟其磷酸化和降解。磷酸化除了影响PER的稳定性，还可增强其抑制转录的能力。

磷酸化修饰调节PER和TIM的稳定性、细胞质到细胞核的转移以及转录抑制因子的功能，从而在生物钟的计时机制中起到极其重要的作用。