肠道屏障功能障碍与胰腺炎：肠道微生物与消化系统疾病的关联

（一）急性胰腺炎患者的肠道通透性增加

急性胰腺炎患者的肠道通透性增加通过几种方法得到证实。肠通透性与血浆内毒素、血清TNF-α、IL-6、CRP及凝血时间（CT）估测的严重程度相关。尿中肠脂肪酸结合蛋白（肠缺血的敏感标志物）的浓度与肠通透性呈正相关，这表明内脏灌注不足会导致肠黏膜完整性的丧失。炎症介质的大量系统生成和早期器官衰竭是SAP的特征。SAP患者结肠黏膜组织中TJPs的表达下降，62%的患者显示BT。此外，BT患者的闭塞蛋白和ZO-1表达水平较低。肠屏障失效与细菌和炎症产物通过肠壁的易位有关，这可能导致坏死胰腺的感染和全身炎症反应。SAP和肠道发育不良患者多器官衰竭和感染性并发症的发生率较高：肠球菌增多，双歧杆菌减少。血清IL-6水平与肠杆菌科和肠球菌丰富度呈正相关，与双歧杆菌呈负相关，而血浆内毒素与肠球菌丰富度呈正相关，提示肠道菌群失调可能是Ⅰ型肠道菌群。

（二）高迁移率族蛋白-1与坏死性胰腺炎

在急性坏死性胰腺炎（ANP）中，胃肠道BT是败血症并发症发生的重要发病机制。尽管高迁移率族蛋白-1（high-mobility group box 1 protein，HMGB1）与ANP患者的BT和器官功能障碍有关，但HMGB-1在肠屏障功能障碍和BT中的作用机制尚未得到很好的解决。Huang等探讨HMGB-1在涉及和肠屏障功能障碍的ANP中的作用。在雄性Sprague-Dawey大鼠剖腹手术后，通过逆行向胆总管注射牛磺胆酸盐，实现实验性ANP。在剖腹手术前立即皮下注射抗HMGB-1抗体进行HMGB-1阻断干预。在诱导ANP 24小时后，收集胰腺和肠道组织以及血液样本进行组织病理学评估和脂质过氧化或谷胱甘肽（GSH）评估。通过肠通透性评估确定AP诱导的屏障功能障碍。采用免疫印迹法、免疫组织学分析和共聚焦免疫荧光成像技术研究紧密连接蛋白和自噬调节因子。结果根据显微镜下的实质坏死和脂肪坏死显示，ANP与肠黏膜屏障功能障碍有关。HMGB-1抑制对肠黏膜屏障功能紊乱起到保护作用，对ANP中的微生物群变化起到保护作用，减轻肠氧化应激。此外，HMGB-1抑制降低了肠道通透性；保留了如claudin-2和occludin等TJ蛋白的表达；降低了自噬。此外，根据双免疫荧光分析，自噬调节因子LC3（自噬标志物）和TJ蛋白claudin-2在ANP中均上调。

HMGB1抑制可改善实验性ANP的严重程度，但对BT有一定的影响，主要涉及TJ功能。

（三）肥胖与胰腺炎

肥胖可通过破坏肠黏膜屏障（intestinal mucosal barrier，IMB）加重AP。其根本机制尚不清楚。

SAP以持续性器官衰竭或感染性局部并发症为特征，被认为是最严重的腹腔疾病之一，死亡率高达10%～30%。肠黏膜屏障功能障碍对SAP的进展起着重要作用。屏障功能障碍通常是由于紧密连接失控和（或）肠上皮细胞（intestinal epithelial cells，IEC）的异常凋亡或增殖，可导致屏障通透性增加，管腔抗原和细菌侵入固有层，触发免疫细胞介导黏膜炎症。肠通透性（intestinal permeability，IP）升高是SAP进展过程中细菌和内毒素易位的主要原因。此外，肥胖被认为是SAP的独立危险因素，可能因为肥胖是诱发慢性炎症状态的因素。生态失调时肥胖患者全身和局部并发症的发生率增加1.68～2.8倍。据报道，由于TJ的下调，肥胖会损害IMB。然而在AP中，肥胖状态下的IMB根本机制尚不清楚。

根据目前的研究，肥胖对胰腺炎的影响有：①肥胖加重胰腺炎。AP诱导肥胖大鼠（OAP）病理评分明显高于AP诱导正常体重大鼠（NAP）；血清乳酸和TNF-α与相应的对照相比，仅在OAP而不是NAP中显著增加。提示肥胖加重炎症。②肥胖导致AP大鼠肠道通透性恶化。体重正常AP（NAP）大鼠血清内毒素水平高于对照组，而肥胖AP组大鼠血清内毒素水平明显高于对照组，P＜0.001，但也明显高于NAP。同时肥胖与AP大鼠内毒素易位升高有关，导致肠道通透性增加。③AP期间肥胖加重肠道炎症性损伤。OAP组肠道组织病理学评分明显高于NAP组，另外，OAP组病理评分升高主要是白细胞浸润，而不是黏膜损伤。④肥胖导致AP期间瘦素和肠Ob-Rb（瘦素作用主要受体）表达不平衡。与NC（假手术正常体重大鼠）组相比，OC（假手术肥胖大鼠）组血清瘦素水平升高，P＝0.004。AP诱导后，OAP组血清瘦素水平不仅高于OC组，而且明显高于NAP组。同样，与NC组相比，OC组回肠瘦素显著升高。然而，在诱导AP后，OAP的回肠瘦素与OC组相比下降了近50%。回肠瘦素蛋白水平与iEC增殖显著相关（P＝0.007），而与凋亡显著相关（P＝0.064）。回肠Ob-Rb的表达随着AP的诱导而增加，但与肥胖无关。⑤肥胖改变AP大鼠回肠微生物多样性及组成。通过微生物组分分析，各群中最丰富的门包括变形杆菌、厚壁杆菌和拟杆菌。OAP组（59.59%）的蛋白菌丰度高于OC组（23.56%），P＝0.013。随着AP的诱导，肥胖显著降低了肠道放线菌比例，NAP 3.15%对OAP 0.11%，P＝0.007。在属级，异种杆菌（NAP 15.85%对OAP 1.85%，P＝0.008，）和巴氏杆菌（NAP 3.66%对OAP 0.06%，P＝0.018）。

肠黏膜的封闭性要求有一个完整的解剖上皮以及有效的顶端细胞连接复合体。许多损伤可能导致黏膜糜烂或坏死、上皮细胞凋亡和增殖失衡，以及TJ蛋白的紊乱。在动物模型中，脆弱的IMB可能处于IMB功能障碍的早期，而不是明显的黏膜糜烂或溃疡。尽管如此，由于内毒素、乳酸和TNFα的易位以及肠道固有免疫的激活，胰腺炎症仍然加重。过度的IEC凋亡可能是肥胖大鼠AP早期黏膜炎症增加的主要原因。

细胞凋亡和增殖受多种因素调控。除了脂肪组织产生的瘦素外，肠瘦素可能是这些因素中的一个，具有加速细胞增殖和减少细胞凋亡的能力。AP促进脂肪组织释放瘦素，但降低了肥胖大鼠的肠道瘦素。在6种类型的瘦素受体中，长形沉默软骨细胞leptin受体（Ob-Rb）是唯一具有完全跨膜和胞内结构的亚型。Ob-Rb也存在于整个肠上皮中，包括在肠上皮细胞的顶端和基底外侧膜中，这表明瘦素和Ob-Rb可能参与了IMB的生理调节，可能是通过旁分泌途径。先前的研究也表明，瘦素/Ob-Rb和炎症介质相互之间的影响是密切的。据推测，瘦素具有双重性质：作为炎症介质和肠道生长因子-28。因此，尽管Ob-Rb的表达没有明显改变，但肥胖AP大鼠肠道瘦素/Ob-Rb结合减少可能通过肠上皮细胞的增殖恶化影响IMB的功能。此外，脂肪组织大量释放循环中的瘦素并没有增强肠瘦素或刺激Ob-Rb的表达，这表明肠瘦素具有旁分泌作用。

此外，以前的研究表明，瘦素可以调节肠道微生物群的组成。无论是瘦素缺乏（ob/ob）还是瘦素受体缺乏（db/db）小鼠，其肠道微生物群落均较野生型小鼠有显著改变。与这些观察结果一致，有研究认为肥胖AP大鼠肠瘦素/Ob-Rb结合减少与回肠微生物群组成的变化有关。以前被报道梭状芽孢杆菌具有抗炎作用，并以其丁酸盐产生能力促进IEC的增殖。AP大鼠梭状芽孢杆菌Ⅺ的比例明显下降，此认为可能与肠道炎症损伤和修复不足有关。这些结果只是观察和推测。瘦素和Ob-Rb对肥胖的肠黏膜屏障（IMB）和肠道微生物群的确切影响需要进一步的实验研究。

总之，肥胖可能导致肠瘦素/Ob-Rb结合降低、细菌丰富度降低、回肠细菌群落的系统发育簇明显、肠炎性损伤增加和AP发作期间IEC增殖不足。所有这些都通过IMB的功能障碍相互作用，甚至在早期即可加重胰腺的损伤。

（四）高三酰甘油与急性胰腺炎

研究证实，高三酰甘油血症（HTG）可加重AP的病程。肠屏障功能障碍与AP的发病机制有关，在此过程中，肠道微生物群的失调导致肠屏障功能障碍。

HTG是AP的一个公认的危险因素。这是第三常见的AP原因，占所有胰腺炎发作病例的10%左右。临床研究报告，ANP患者的HTG遭受更严重的临床过程和并发症，包括感染、败血症和多器官衰竭。动物实验还证明，使用AP的HTG可扩大胰腺和全身炎症反应。高脂肪饮食（HFD）是影响肠道微生物群组成的一个因素，并导致低度肠道炎症和肠道通透性增加。

1.HTG加重肠屏障通透性的变化及ANP患者血浆和回肠远端炎症细胞因子的表达　测定血浆二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）和D-乳酸水平，以评价肠屏障功能障碍的严重程度。与之前的研究一致，ANP诱导后肠屏障受到损伤，其特点是DAO和D-乳酸表达水平显著增加。与假手术（sham operate，SO）组相比，HSO（高三酰甘油假手术）组DAO和D-乳酸表达水平显著升高。HANP（高三酰甘油急性坏死性胰腺炎）组24小时和48小时DAO和D-乳酸的表达水平均高于NANP组同期（P＜0.05）。其中HANP48小时组血浆DAO和D-乳酸A的表达水平最高。(www.xing528.com)

TNF-α在SAP中起着关键作用，可触发其他炎性细胞因子如IL-1β的表达，并加重组织损伤。产生IL-17需要IL-1β，它们都是AP中重要的促炎细胞因子。用酶联免疫吸附测定系统和肠道中TNF-α、IL-1β和IL-17a的表达水平。ANP诱导后血浆炎性细胞因子增加。与SO（三酰甘油假手术）组相比，HSO（高三酰甘油假生手术）组血浆TNF-α、IL-1β和IL-17a表达水平升高，但无统计学意义。与NANP组相比，HANP组血浆TNF-α水平明显升高（P＜0.05）。HANP组48小时血浆IL-1β和IL-17a水平较48小时NANP组显著升高，高于HANP 24小时组水平（P＜0.05）。与NANP 48小时组相比，HANP组在48小时时肠道IL-1β和IL-17a水平显著升高，高于HANP 24小时组水平，P＜0.05。这些结果表明，HNAP大鼠的肠道炎症较重。

2.HTG相关ANP中肠道微生物多样性和结构的变化　ANP诱导后48小时肠组织病理变化及肠屏障损伤较严重。因此，分析了SO 48小时、NANP 48小时、HSO 48小时和HANP 48小时组的肠道微生物群。用测序方法从40个样品中共获得650 600个高质量序列和910个OTU。稀疏曲线倾向于饱和平稳，所有物种多样生指数（Shannon diversity）都是稳定的，这表明大多数多样性已经被发现。

群落α-多样性的估计值反映了HSO 48小时组肠道微生物多样性下降，而HANP 48小时组在这四组中的多样性最低。与SO 48小时组相比，OTU、Chao 1和ACE指数显著降低了HSO 48小时组的肠道菌群多样性（P＜0.05）。用OTU、Chao 1、ACE、Shannon和Simpson指数的估计值表明，HANP 48小时组的肠道微生物群多样性明显低于NANP 48小时组。

肠道微生物群结构的整体变化。在门水平上，HSO 48小时组与SO 48小时组相比，Candidatus＿Saccharbacteria和Tenericutes（软壁菌门）的丰度显著降低（P＜0.05）。ANP诱导后，这两个门的丰度进一步降低。其丰度在HANP 48小时组最低，与NANP 48小时组相比显著降低（P＜0.05）。其中放线菌数量以HANP 48小时组最高，与NANP 48小时组相比呈显著增加（P＜0.05）。在属水平上，HSO 48小时组的Parasutterella、异杆菌和双歧杆菌的丰度高于SO 48小时组，而只有Parasutterella和双歧杆菌的增加具有统计学意义（P＜0.05）。ANP诱导后，HANP 48小时组与NANP 48小时组相比，其丰度显著增加（P＜0.05）。与SO 48小时组相比，HSO 48小时组的异源普雷沃菌、Candidatus＿Saccharbacteria和瘤胃球菌类UCG-014的丰度显著降低（P＜0.05）。经ANP诱导后，这三个属的丰度在四组中均最低，而在HANP 48小时组则下降。与SO 48小时组相比，HSO 48小时组Christensenellaceae＿R-7＿组（有益菌，可减肥）、Rikenellaceae＿RC9（理研菌科＿RC9菌群）肠道组和瘤胃球菌科＿UCG-005的丰度显著降低（P＜0.05）。其丰度在ANP诱导后发生变化，与NANP 48小时组相比，HANP 48小时组明显降低（P＜0.05）。与NANP 48小时组相比，ANP组术后厌氧菌和瘤胃梭菌数量减少，而HANP 48小时组明显减少（P＜0.05）。综上所述，这些数据表明，HTG和ANP可能在导致肠道微生物群结构变化方面发挥重要作用。

3.在HTG相关的ANP中抗菌肽表达下降　为了研究HANP过程中潘氏细胞AMP表达水平的变化，采用实时PCR和免疫荧光法检测回肠远端溶菌酶和α-防御素5的mRNA和蛋白质表达水平。通过实时聚合酶链反应，溶菌酶和α-防御素5的mRNA表达水平在ANP诱导后下降。HSO组与SO组比较，这两种AMP均显著降低，P＜0.05。在HANP组，溶菌酶和α-防御素5的mRNA水平明显低于NANP组，P＜0.05）。免疫荧光结果显示ANP诱导后回肠远端潘氏细胞溶菌酶染色降低。HSO组的溶菌酶染色较SO组下降，而HANP组的溶菌酶染色较NANP组进一步下降。潘氏细胞的定量分析表明，ANP诱导后潘氏细胞数量减少。与SO组相比，HSO组潘氏细胞数减少，但无统计学差异。在HANP 48小时组，与NANP 48小时组相比，潘氏细胞数量显著减少。另外发现在NANP 48小时和HANP 48小时组中，同种异体细菌的丰度与溶菌酶的表达水平呈负相关（r＝－0.943，P＜0.05），而通过Spearman试验，厌氧菌的丰度与溶菌酶的表达呈正相关（r＝0.886，P＜0.05；F＝0.05）。

4.SAP中肠道微生物群结构的改变　与以前的研究类似，最新研究结果显示了在ANP期间特定系统类型的相对丰度变化。在研究中，发现HANP组的微生物多样性与NANP组相比明显下降，肠道微生物群结构也发生了变化。与正常血脂组和HTG组比较，HANP组Candidatus-＿Saccharbacteria和厚壁菌门水平有所下降。在属级上，HANP组的坦纳拟普雷沃菌属、厌氧棍状菌属、Christensenellaceae＿R-7＿组和瘤胃球菌的几个属数量均减少，而Ruminococcaceae（瘤胃菌科）菌家族、Allobaculun（坦纳拟普雷沃菌）和Parasutterella（核心共生菌）数量增加。alloprevotella是一个最近被确认的属，在活跃龋齿的牙髓感染分离株中发现。据报道，11周内食用含3%葡萄的低脂饮食的小鼠体内Allobaculum菌数量增加，这表明异杆菌可能与代谢健康改善有关。研究发现晚期克罗恩病患者的黏膜下组织中的Parasutterella菌增多。尽管上述每个肠道菌群在HANP中的具体作用尚不清楚，但研究结果证实了肠道菌群存在结构上的整体变化。

潘氏细胞通过分泌包括α-防御素、溶菌酶、分泌型磷脂酶A2和RegⅢA在内的多种AMP来塑造和影响肠道微生物群的结构。潘氏细胞功能紊乱与肠屏障损伤密切相关，导致细菌易位。在先前的研究中，Teltschik等研究了肝硬化大鼠潘氏细胞的功能，发现了与细菌易位相关的α-防御素5、α-防御素-7和溶菌酶等AMP表达降低。最近的一项研究表明高脂肪饮食改变了肠道微生物群的形态，降低了潘氏细胞AMP的表达，从而刺激了肠道炎症。与此类似，研究结果表明，HTG组的潘氏细胞AMP（溶菌酶和α-防御素5）水平低于正常脂质组。诱导ANP后，这两种AMP进一步降低。与NANP组相比，HANP组溶菌酶和α-防御素-5的表达明显下降。综上所述，这些发现表明，HTG可能通过影响潘氏细胞AMP的表达而加重HANP的肠屏障功能障碍。

此外，还有研究分析了NANP和HANP组中微生物群与溶菌酶表达水平的相关性。HANP组同种异体杆菌丰度显著增加，与溶菌酶表达呈负相关。由于在先前的研究中，Allobaculum被认为在肠道中起到了积极作用，假设Allobaculum可能随着溶菌酶的减少而增加，以保护肠道，但需要进一步的研究来阐明其在HANP的特殊功能。

（五）铜-果糖相互作用改变雄性大鼠肠道微生物活性

经近几年的研究，果糖在肠道细菌过度生长、肠道通透性和内毒素血症的诱导中所起的作用已被充分证实。一些证据表明，铜可能参与肠道微生物群和肠道屏障功能的调节。首先，铜在各个年龄段都被用作抗菌剂。其次，不同细菌对铜胁迫的反应差异很大。铜稳态似乎是脂肪变性发病机制中的一个重要因素。然而，饮食中铜-果糖的相互作用是否以及如何通过改变肠道微生物群和肠道屏障功能而促进脂肪变性的发展仍不清楚。

当前研究的主要发现是，饮食中的低铜果糖和高铜果糖相互作用都会导致肠道屏障功能受损，并发现与肠道微生物群的明显改变有关。不同剂量的膳食铜和（或）果糖可能以不同的方式形成肠道微生物群。

宏基因组学研究揭示了低、高铜与果糖在塑造肠道微生物群中的共同特征。这包括：在CuSF（高糖＋果糖）大鼠中，厚壁菌门显著增加，变形杆菌增加，疣微菌科（Akkermansia，阿克曼西亚）耗空，疣微菌和双歧杆菌显著减少；而在CuMF（糖＋果糖）大鼠中，减少的程度较小。双向方差分析揭示了铜在塑造厚壁菌（乳酸杆菌科、乳酸杆菌科、丹毒菌科等）和疣菌科（阿克曼菌科）中的重要作用，以及膳食果糖在促进变形杆菌和铜及果糖的同时降低蛋白质含量方面的重要作用。瘤胃球菌科、Akkermansia和双歧杆菌都有利于宿主，并在维持肠道屏障功能中发挥关键作用，突出了铜稳态在肠道屏障功能中的重要作用，此作用可能通过维持肠道微生物群的正常生长得以完成。尽管低铜和高铜增加厚壁菌达到相似的程度，但厚壁菌/拟杆菌比例来看，CuMF（边缘铜＋果糖）大鼠的厚壁菌/拟杆菌比率高于CuSF大鼠，这是因为CuMF大鼠的拟杆菌较低。低铜喂养大鼠厚壁菌增加的主要原因是毛螺旋菌（Lachnospiraceae）和消化链球菌科（Peptostroptoccocaceae）增加，高铜喂养大鼠厚壁菌增加的主要是乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）、毛螺旋菌和韦荣球菌科（Erysipelotrichaceae）细菌增加。消化链球菌科和韦荣球菌科的增加与高热量饮食诱导的小鼠肝脏脂肪变性有关，这可能导致疾病进展。此外，喂食高脂肪饮食的小鼠显示类杆菌减少，而变形杆菌和乳酸杆菌增加。研究中发现，低铜/高果糖喂养大鼠的特征是厚壁菌/拟杆菌比率更高，而高铜/高果糖喂养大鼠的乳酸杆菌和丹毒杆菌科显著升高，双歧杆菌显著减少。粪便代谢组学表明，粪便代谢产物的明显变化与饮食中的铜含量和果糖有关，进一步支持通过宿主微生物相互作用的差异机制可能有助于脂肪变性的发展这一概念。然而，改变的肠道微生物群和代谢物是如何促进脂肪变性的发病机制仍不清楚。

除了肠道微生物群的改变外，我们的数据还表明，饮食中含或不含果糖的低铜和高铜在破坏肠道屏障功能方面起着关键作用，因为肠道紧密连接蛋白明显下调，杯状细胞数量减少。此外，破坏的肠道屏障功能与肠道微生物群失调有关，其特征是Akkermansia缺失，这已被充分证明对维持肠道屏障功能至关重要。据我们所知，这是首次研究表明铜水平对阿克曼病的具体影响。今后需要进一步研究铜稳态是否直接作用于肠道屏障的完整性和（或）通过诱导肠道微生物群失调而起作用。

另一个有趣的发现是内毒素血症只存在于CuMF大鼠，而不存在于CuSF大鼠。此外，肠道革兰阴性细菌（肠杆菌科）的数量增加并不能与血浆内毒素水平平行，尽管这两种方案都导致肠道通透性增加，这进一步支持了一种观点，即不同机制导致肠道通透性增加。

血浆内毒素水平与肠道通透性增加以及革兰阴性细菌数量增加之间的不一致表明除了脂多糖以外的细菌产物可能有助于脂肪变性的发展。研究发现，与细菌鞭毛生长相关的大肠杆菌H7抗原表达在CuS（高铜）和CuSF（高铜＋果糖）大鼠中显著增加。鞭毛蛋白是鞭毛的主要成分，是一种Toll样受体-5配体。肠道细菌来源的鞭毛蛋白是否有助于脂肪变性仍有待确定。在CuMF和CuSF大鼠中发现血浆LSP水平升高提示血浆LPS升高的可能性。最近一项研究表明，来自不同细菌的脂多糖具有不同的结构，这可能是在免疫反应中发挥不同的作用所致。