肠道微生物与肝纤维化研究进展

肝纤维化是慢性肝炎（包括酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、病毒性肝炎、胆汁淤积性肝病和自身免疫性肝病）引起的创面愈合性瘢痕反应。肝脏在胃肠道内具有独特的血管系统，因为肝脏的大部分血液供应来自肠道，通过门静脉进入肝。当肠屏障功能被破坏时，肠通透性的增加导致肠源性细菌产物如LPS和含有DNA的未甲基化Cp G经由门静脉转运到肝脏。这些肠源性细菌产物刺激肝脏中的天然免疫受体，即TLR。TLR在库普弗细胞、内皮细胞、树突状细胞、胆管上皮细胞、肝星状细胞和肝细胞上表达。TLR激活这些细胞从而促进急性和慢性肝病。从昆虫到哺乳动物，先天免疫广泛存在，并且是作为宿主抵御病原微生物（细菌、病毒、真菌和寄生虫）的第一道防线。先天免疫系统诱导炎症介质和抗微生物肽的产生，并与获得性免疫建立桥梁，以消除来自宿主的入侵微生物。先天免疫信号还维持组织和器官稳态，如肠道微生物区系、肠上皮细胞增殖和凋亡，以及肝脏质量损失后的肝脏再生。

肝脏是第一个通过门静脉接触来自小肠和大肠的静脉血液的肠外器官。由于这种独特的血液供应系统，肝脏容易暴露到通过门静脉从肠腔转移的细菌产物。肠上皮屏障的破坏导致肠漏，这有助于细菌易位。肠上皮细胞提供的完整屏障系统通常可以防止大量肠源性产物的转移。因此，在健康生物体中，只有少量易位的细菌产物到达肝脏。一般来说，肝脏免疫系统能耐受这些细菌产物，以避免有害反应，这也被称为“肝耐受”。肝脏不仅由肝实质细胞组成，还包括免疫细胞和非免疫细胞的非实质细胞。肝脏免疫系统的成员是常驻肝组织巨噬细胞（库普弗细胞）、NK细胞、T细胞和B细胞；这些细胞类型严格调节肝脏免疫系统，包括肝脏耐受。

细菌易位是指活的细菌或细菌产物从肠腔迁移到肠系膜淋巴结或其他肠外器官和部位。细菌易位是由于肠屏障破裂导致肠通透性增加而引起的。肠道细菌过度生长和肠道细菌菌群组成的变化也可能促进细菌易位发生。细菌和细菌产物从肠内易位的增加可能损害肝脏内稳态，并通过激活先天免疫系统增强肝脏炎症。尤其是易位的细菌产物通过包括TLR的模式识别受体可增强肝免疫细胞的激活。此外，肝脏非免疫细胞，包括内皮细胞、胆管上皮细胞和肝星状细胞，通过TLR对细菌产物做出反应。激活的TLR信号转导诱导肝脏内先天免疫应答，包括细胞因子和Ⅰ型干扰素的产生。警报素是从受损细胞或组织释放的产物，也可触发TLR信号的传导，并可引起炎症，称为无菌炎症。因此，通过肠源性微生物产物和警报素激活TLR信号可能有助于肝脏疾病的启动和进展。

（一）肝脏中Toll样受体信号转导

TLR最初被鉴定为果蝇Toll的哺乳动物同源物，并且作为模式识别受体。TLR识别特征基序，通常称为病原体相关分子模式（PAMP），其激活TLR的下游细胞内信号传导途径，导致先天免疫应答的诱导。目前，已经鉴定出TLR家族的10多个成员，并且所有TLR都包含一个具有富含亮氨酸的重复序列的保守的细胞外结构域，负责PAMP的识别。革兰阴性细菌细胞壁成分LPS和TLR-4与共受体CD14（白细胞分化抗原，即LPS受体）和MD-2（myeloid differentiation 2，髓样分化蛋白-2）结合，使TLR2与TLR1或TLR6异二聚识别来源于革兰阳性细菌的脂蛋白和肽聚糖。细菌鞭毛蛋白由TLR-5识别。细胞内TLR-3和TLR-9分别由微生物衍生的核酸激活，包括双链RNA和含有未甲基化DNA的Cp G基序。在相应的配体结合后，TLR激活MyD88依赖的和非依赖的信号传导途径。MyD88依赖途径由TLR和IL-1受体信号传导共享。除了TLR-3，所有TLR都激活MyD88依赖途径。一个附加的适配子蛋白，Toll-IL 1受体（TIR）域接头蛋白（Toll-interleukin1 receptor domain containing adaptor protein，TIRAP），桥接TLR-2和TLR-4到MyD88（图18-6）。随后，MyD88募集IL-1R相关激酶（Interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK，白细胞介素-1受体相关激酶）-4、IRAK-1和IRAK-2，并诱导由肿瘤坏死因子受体相关因子-6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）、TRAF3、泛素蛋白连接酶（ubiquitin conjugating enzyme，Ubc13）、细胞凋亡抑制蛋白1/2（cellular inhibitor of apoptosis protein 1/2，cIAP1/2）、转化生长因子活化激酶1（transforming growth factor activated kinase-1，TAK1）和NEMO（NF-κB必要的调制器）组成的多蛋白复合物的组装。然后，TRAF6和TRAF3被泛素化和降解，导致下游IKK（IκB kinase，IκB激酶）复合物和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的激活。IKK复合物由IKKα、IKKβ和NEMO组成，诱导IκBα的磷酸化、泛素化和降解。从IκBα分离后，NF-κB转运到细胞核。MAP激酶包括c-Jun N端激酶（JNK）和p38激活转录因子活化蛋白1（acticvator protein1，AP-1）。这些转录因子的激活可诱导促炎细胞因子如TNF-α、IL-6和IL-1β的转录。内体TLR-7和TLR-9的激活诱导了由MyD88、IRAK-1、TRAF6、TRAF3和IKKα组成的复合物的组装。TLR-7或TLR-9介导的IKK、MAP激酶和干扰素调节因子（interferon regulation factor，IRF7）的激活需要这种复合物。IRF7激活随后诱导IFN-α的产生。

TLR3和TLR4激活MyD88独立的诱导干扰素β的TIR结合与连接子（TIR-domaincontainingadapter-inducing interferonβ，TRIF）经典途径。当TLR-4与另一适配分子TRAM结合时，TLR-4从质膜内化到细胞质中，然后与TRIF相互作用。随后，TRIF与TRAF-3和TRAF-6结合以激活TANK结合激酶-1（TBK1）和IKKi，导致转录因子IRF3的激活和IFN-β的诱导（图18-6，见彩图）。TRIF经典途径要求TRAF3通过RIP-1和RIP-3诱导IL-10产生和TRAF-6诱导NF-κB和MAPK的晚期激活。TBK-1又称NF-κB活化酶（NAK）作为非经典的IκB激酶（IKK）之一，在调节IRF3信号通路和NF-κB信号通路中发挥重要作用。

（二）TLR4信号转导在肝纤维化中的作用

肝纤维化是慢性乙型肝炎、丙型肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎等慢性肝炎引起的伤口愈合反应。由胆道梗阻或炎症引起的胆汁淤积症也诱发肝纤维化。肝硬化是肝纤维化的终末阶段，在组织学上以肝细胞坏死、炎症细胞浸润、桥接性纤维化和再生结节的出现为特征，并可能导致门脉高压、肝衰竭和肝细胞癌。临床证据显示肝硬化患者全身和门静脉循环LPS水平升高。因此，推测TLR-4和肠道微生物源LPS参与了肝纤维化的进展。实际上，在胆管结扎（BDL）和慢性给予四氯化碳（CCl4）或硫代乙酰胺诱导的肝纤维化的实验动物模型中，血浆LPS水平升高。使用非吸收性广谱抗生素的鸡尾酒选择性地去除肠道微生物区系会降低血浆LPS水平并抑制实验性肝纤维化，提示肠源性位细菌产物如LPS可促进实验性肝纤维化。预计TLR-4突变体C3H/HeJ小鼠的实验性肝纤维化被抑制。缺乏TLR-4共受体、CD14和LPS结合蛋白以及TLR适配子MyD88和TRIF的小鼠也较少发生由胆汁淤积介导的肝纤维化。重要的是，与野生型小鼠相比，TLR-4突变小鼠血液中LPS升高的水平相似。这表明来自肠道菌群的易位LPS介导肝脏中TLR-4的激活，然而，这种易位与肠道TLR-4无关。肠黏膜屏障缺损可能是由于肠上皮紧密连接中断、肠上皮细胞增殖和凋亡失衡、肠黏膜萎缩和门静脉高压水肿、肠腔内胆汁酸缺乏以及炎性细胞因子增加所致。(www.xing528.com)

（三）库普弗细胞与肝星状细胞TLR-4信号转导的相关性研究

库普弗细胞和HSC都高水平的表达TLR-4。通过产生TLR-4-骨髓（BM）嵌合小鼠，研究TLR-4在库普弗细胞和HSC之间在肝纤维化中的相对作用。由于大多数库普弗细胞是抗辐射的，标准的照射式骨髓移植（BMT）不足以将供体骨髓来源的细胞移植成为肝巨噬细胞。即不能用供体BM（骨髓）衍生的细胞来代替内源性库普弗细胞。这个方案可以产生两种不同类型的TLR-4 BM嵌合小鼠，一组包含TLR-4突变的库普弗细胞和TLR-4完整的HSC和肝细胞。而另一种类型包含TLR-4完整库普弗细胞和TLR-4突变的HSC和肝细胞。因为库普弗细胞和HSC，而不是肝细胞，在体内直接对TLR-4配体做出反应，并且因为HSC是抗辐射的，而不是来源于BM。利用改良的TLR-4 BM嵌合小鼠研究TLR-4在库普弗细胞和HSC中的相对作用。Seki等研究发现具有TLR-4突变型HSC和TLR-4完整型库普弗细胞的小鼠缺乏显著肝纤维化的诱导，而具有TLR4完整型HSC和TLR4突变型库普弗细胞的小鼠在TLR4嵌合小鼠中显示出明显的纤维化诱导。因此，在HSC中，而不是在库普弗细胞中，TLR-4信号转导对于肝纤维化的发展是至关重要的。

目前，至少有三种机制被鉴定为TLR-4信号在肝纤维化过程中对HSC的作用。第一种机制是通过TLR-4诱导的趋化因子［单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）］、心肌缺血上调蛋白1（myocardial ischemia upregulated protein 1，MIP-1）α、MIP-1β和受激活调节正常T细胞表达和分泌因子（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES）和黏附分子［细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion mole-cule 1，VCAM-）和E-选择素］的表达介导的。这些HSC衍生因子导致BM衍生单核细胞的化学吸引和库普弗细胞在肝脏的蓄积。此外，HSC衍生的MCP-1和RANTES以自分泌方式激活HSC，这也有证据表明，对趋化因子（RANTES、MCP-1）或趋化因子受体（CCR1、CCR2、CCR5）的遗传或药理学抑制可减少肝纤维化（图18-7，见彩图）。第二种机制是通过TLR-4和TGF-β信号之间的相互作用介导的。TGF-β是激活HSC并诱导肝纤维化的强效成纤维细胞因子。在静止HSC中，TGF-β受体的内源性诱饵受体骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂［bone morphogenetic protein（BMP）and activin membrane-bound inhibitor，（BAMBI）］高度表达并抑制TGF-β受体信号传导。在TLR-4刺激后，BAMBI立即下调，这允许HSC中TGF-β受体信号完全激活，导致HSC激活（图18-7，见彩图）。TLR-4介导的BAMBI调节依赖MyD88和NF-κB，但不依赖TRIF。此外，BAMBI不仅起诱饵作用，而且与Smad7直接相互作用，干扰TGF-β受体（Ⅰ型和Ⅱ型）和Smad3之间的联系，从而抑制TGF-β信号传导。最近的一篇报道表明，在肾纤维化中，BAMBI调节TLR-4介导的纤维化发生，表明BAMBI在纤维化中的普遍作用。第三种机制是通过TLR-4调节的微RNA（miR）在肝纤维化中的表达介导的。LPS刺激可降低HSC中miR-29的表达。此外，在肝纤维化的人和动物肝脏中，miR-29的表达受到抑制。miR-29负性调节胶原α1（I）mRNA的转录，表明TLR-4信号转导下调。miR-29的表达，这反过来促进肝纤维化中的胶原生成。

（四）细菌易位与肝硬化

细菌易位是由于肠通透性增加引起的，肠通透性增加可能是由于肠紧密连接中断和肠道细菌过度生长所致。胆道梗阻或肝硬化介导的肝功能障碍可减少引起细菌过度生长的胆汁酸的分泌，并可能改变肠道中的细菌组。此外，肝硬化和门静脉高压可能影响肠道运动，这也可能导致肠道细菌过度生长。

目前尚不完全清楚微生物群的变化如何导致慢性肝病。四氯化碳诱导的大鼠肝硬化与高水平的肠杆菌科有关。另一项研究报告了革兰阳性厌氧梭菌群在纤维化小鼠中的减少和有氧/厌氧细菌比例的增加。对于患有肝硬化的动物，用抗生素（如诺氟沙星）或益生菌（如双歧杆菌）治疗可减少肠杆菌，同时可增加双歧杆菌和乳酸杆菌，导致系统性内毒素水平降低和改善肝功能。因此，提示细菌移位和肠道菌群失调与肝纤维化的发生有关。