核酸检测方法在肠道微生物研究中的应用

以往对菌群的研究通常是基于传统方法，近年来，随着现代分子生物学研究的飞速发展，基因检测技术在微生态研究方面得到了广泛的应用。对于用分离培养方法不能检测的微生物，核酸检测更显优势，常用的有基于DNA指纹图谱的分析方法、基于DNA测序的检测方法、基于分子杂交技术的分析方法以及近年来得到高速发展的宏基因组学方法。现代核酸技术为生物学的研究带来新的革命，它使人们对于生命现象的研究更为深入，成为揭示生物科学规律的有力手段。分子生态技术的应用克服了培养技术的限制，可更精确地揭示菌群种类和遗传的多样性。

（一）基于DNA指纹图谱的分析方法

DNA指纹图谱技术是制备微生物群落中各菌种的DNA分子标记物，将其在凝胶上进行电泳分离，根据核酸分子大小、序列等特征的不同，使代表不同菌种的分子标记迁移到不同位置，最终得到的电泳图谱可显示微生物群落的组成结构。DNA指纹图谱的最大优点是方便、快速、直观，常用于检测肠道微生物群的动态变化或比较不同个体之间的结构差异。最常用的DNA指纹图谱技术有随机扩增多态性DNA技术（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、扩增片段长度多态性技术（amplified restriction fragment-polymorphism，AFLP）、限制性片段长度多态性技术（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和末端限制性片段长度多态技术（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）、单链构象多态性技术（single-strand conformation polymorphism，SS-CP）、变形梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、核糖体基因间区分析（ribosoma intergenic spacer analysis，RISA）等。

近年来，16S r DNA的分子生物学技术大大促进了微生态研究的发展，特别是变性梯度凝胶电泳技术（DGGE），该技术利用含有变性剂（尿素和去离子甲酰胺）梯度的聚丙烯酰胺凝胶把相同长度但序列不同的DNA片段分离开来，并且能有效分析复杂微生物群落及其多样性且无须培养微生物。DGGE技术避免了分离纯化培养所造成的分析上的误差，通过指纹图谱直接再现群落结构，由于其分辨率高、检测片段长、操作简便快速、重复性好、可靠性高等优点，目前已经成为微生物群落遗传多样性和动态性分析的强有力工具。

应用DNA指纹图谱技术的方法来分析肠道微生物群极大地提高了目标菌鉴定的灵敏性和特异性，但是分析的前提必须是已知基因的微生物。所以，肠道微生物群的研究和分析由于手段的限制，尚未能真实全面地反映肠道微生物群的生存状态。目前在全球范围内对肠道微生物群丰度与数量准确变化的方法仍有待突破。

（二）基于DNA序列测定的研究方法

不同于指纹图谱技术，DNA测序技术是通过直接获取核酸序列信息对菌群中各菌种的进化地位做出判断。目前，几乎所有已知细菌的16S rDNA碱基序列已被测定并存入基因库。在肠道微生物群的研究中，混合基因组的扩增产物经纯化后可直接进行测序或通过TA载体建立16S r DNA基因文库再进行全序列分析。所得序列可通过GenBank、EMBL、DDBJ、RDP等数据库进行序列比较来确定其种、属，并根据序列的同源性，计算不同菌种之间的遗传距离，然后采用聚类分析等方法，将细菌进行分类，并将结果用系统发育树（phylogenetic tree）表示。但序列测定相对费用较高，且全序列分析法不能进行准确的定量，只能定性得出菌群组成的多样性。故在实际工作中常常与前述的DNA指纹图谱技术相结合，在用DNA指纹技术初筛后对某些特定条带进行基因克隆、测序，再对所得到的序列进行分析。

（三）基于分子杂交技术的分析方法(www.xing528.com)

基于分子杂交技术的分子标记法，如荧光原位杂交、基因芯片技术等，可对微生物在特定环境中的存在与否、分布模式及丰度等情况进行研究，具有较高的灵敏性和特异性。

1.荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）　该方法根据不同种属细菌的16S r RNA中的特异性片段设计探针，以荧光作为信号，杂交后在荧光显微镜下对相应的细菌计数。优点是在保持组织结构和细胞原貌的情况下能特异性显示检测细菌与组织细胞的结构关系，因此在研究肠道细菌之间、肠道细菌与肠道组织的结构功能关系方面具有不可替代的优势。特别是该方法常用于以16S r RNA为目标的非培养细菌计数，能够对微生物进行检测、对微生物群落进行分析及对特定菌群进行空间定位和原位生理学研究，同时具有操作简单、方便快捷、结果可靠的优点。

2.基因芯片技术　基因芯片又称DNA芯片或DNA微阵列。其原理是将大量特定核酸序列的探针分子密集、有序地固定于经过相应处理的硅片、玻片或硝酸纤维素膜等载体上，然后加入标记的待测核酸样品，进行多元杂交，通过杂交信号的强弱及分布，来分析目的分子的有无、数量及序列，从而获得受检样品的遗传信息。基因芯片能够同时平行分析数万个基因，进行高通量筛选与检测分析。利用肠道细菌16S r DNA基因作为检测的靶基因，设计针对不同菌属的寡核苷酸探针以制备基因芯片，可以通过杂交反应来检测肠道微生物群。

（四）宏基因组学

宏基因组学（metagenomics）也称元基因组学，是指不依赖于培养，对特定环境中的微生物群落基因组进行研究的一种新方法，是微生物学发展历程中继显微镜技术后又一大开创性的技术突破。由于传统研究方法的局限性和多数细菌的不可培养，人们对肠道微生态系统中具体的微生物种类、数量、其蕴含的遗传信息、潜在的代谢功能、与人体某些疾病的关联性等都没有相对明确的概念。但宏基因组学的发展，让人类看到了对肠道微生物群研究的曙光，特别是随着第二代、第三代测序技术的发展和海量数据的丰富，宏基因组学的研究呈现出革命性的变革。国内外相继启动了一系列大的研究计划，包括美国NIH 2007年宣布正式启动的人类微生物组计划、欧盟2010年启动的“人类肠道宏基因组计划”等。

宏基因组学对人体肠道微生物群的研究主要包含两方面的内容：一是高通量测序DNA样品中16S r RNA基因，分析菌群的组成和结构；二是直接对样品中所有基因组DNA进行测序，以研究菌群的种类和功能。这两种方式各有侧重且互为补充，已在肠道、口腔、皮肤等人体各部位的微生态研究中广泛开展，其在揭示不同健康水平或疾病发生的不同状态下菌群结构、功能基因的差异等方面显示出巨大潜力。