植物激素免疫组织化学定位技术

植物激素的免疫组织化学定位技术在阐明植物激素的作用机理研究方面被寄予了很大的期望,是非常有魅力的研究领域。虽然如此,植物激素的免疫组织化学定位研究的历史却十分短暂,有关的文献也屈指可数。这也许是植物激素的免疫组织/细胞化学研究中确实存在着一些比较棘手的难题的缘故。

在使用免疫组织化学定位方法之前,很多研究者也曾对植物激素的组织以及细胞水平的定位研究做过一些尝试。其中研究最多的是利用放射自显影法进行放射性标记的外源植物激素在植物体内分布的研究。这种方法不仅可以非常方便地进行植物整体的激素分布情况的研究,而且利用化学固定剂或者是快速冻结的方法,甚至可以实现细胞水平的定位观察。近年来光敏亲和标记法也被应用于植物激素的定位研究。尽管这些研究对了解植物激素在组织和细胞内的存在及其作用部位有一定的参考价值,但大多数是利用外源的标记激素所进行的实验,存在着相当多的局限性,不能完全地真实反映在各种生理过程中植物内源激素的分布情况。随着免疫组织化学技术在植物激素测定上的应用,人们开始探讨应用免疫组织细胞化学的手段解决植物激素的定位问题的可行性,并且积累了许多有价值的资料。

1.植物激素免疫组织化学定位基本原理

植物内源激素在同一器官不同组织之间,甚至同一组织的各个细胞之间的分布差异悬殊,单靠免疫定量技术不能进一步认识细胞内各种激素的区域化分布。因此,更有赖于免疫定位技术的发展。

免疫组织化学定位技术的基本原理与固相抗原型酶联免疫吸附检测法相同,也是以抗体与抗原和半抗原之间的特异性结合为基础。通常在植物细胞中,以结合态和游离态的某种激素分子为目的物,需预先进行固定,然后用直接法和间接法进行标记定位。直接法是使用与标记物相连的一种抗体识别并且显示该目的物;间接法是先用一种非标记的、能与目的物特异性结合的抗体(第一抗体)共同温育切片,然后再用标记的第二抗体去识别并结合于第一抗体的Fc片段上。间接法比直接法更灵敏,因为它通过两步识别可以产生明显的放大效应。

与动物激素的免疫组织化学或细胞化学研究相比,植物激素的免疫组织细胞化学研究存在一些特殊的难题。

(1)由于植物细胞存在着细胞壁的障碍,不利于固定剂的渗透,并阻碍染色时抗体与抗原反应。

(2)植物激素在组织中的浓度极微,而且分子质量小,抗原性差,不利于免疫检测。

(3)植物组织中存在着大量的激素类似物及其他干扰物质,更增加了研究的难度。

(4)植物激素分子量小,易溶于多数有机溶剂,在水溶液中也有一定的溶解度,而且也不像蛋白质那样容易被普通的固定剂所固定。所以在组织和细胞内比大分子更容易移动和渗漏。因此在植物激素的定位研究中,最关键的问题是如何维持植物激素在组织及细胞内的原位性。考虑到在普通的石蜡切片和树脂切片的制备过程中,诸如固定、包埋、脱水以及以后的染色过程中,都需要经过相当频繁的溶液或溶剂处理。如果不能有效地进行固定,植物激素的组织及细胞定位几乎是不可能的。所以在植物激素的免疫定位研究中,必须针对上述问题和植物材料的特殊性采取相应的对策。

目前解决这一问题的基本策略是利用交联剂(如戊二醛、多聚甲醛、碳二亚胺等)将植物激素小分子结合到其周围的蛋白质上使之得到固定。

2.植物激素的固定和标记方法

(1)植物激素的固定方法

①溶液化学固定法

激素的溶液化学固定法是将溶解于水溶液或者是有机溶剂的化学交联剂渗透到材料中,经化学反应使激素小分子与细胞内的蛋白质类大分子共价结合而获得固定的方法。虽然在植物激素免疫化学定位研究中,大多数都采用了这种溶液化学固定法,但是这种固定法显然不能避免固定过程中激素的移动和流失,从根本来说不适用于植物激素的免疫组织化学定位研究,尤其是不适宜于激素分子在细胞超微结构水平上的定位。为了克服溶液化学固定法的这个缺陷,许多研究者尝试着采用了其他植物激素的固定法。(www.xing528.com)

②低温置换(化学)固定法

在维持细胞内成分,尤其是可溶性成分的原位性方面,目前最理想的方法是冻结固定法。冻结材料在进行包埋和切片前,必须先进行脱水。低温置换(化学)固定法就是利用在熔点附近的丙酮和乙醇溶解到冰里面的性质,将冻结材料内的水分在-80℃左右用丙酮或乙醇进行置换,同时用预先溶解在置换液中的化学固定剂(如锇酸等)对组织和激素进行固定的方法。由于低温置换(化学)固定法是在细胞溶液的再结晶化点(Tr)以下的温度进行的,所以能够防止由于温度的上升使冻结材料再结冰现象的发生,在目前的生物材料固定法中该法是最优秀的方法之一。

虽然低温置换(化学)固定法比溶液化学固定法已经有了长足的进步,但是仍然存在着很大的缺陷。例如在长时间的低温置换过程中,植物组织中的激素小分子会溶解在置换溶液中,从而发生移动和流失。而且利用同位素标记的赤霉素和琼脂块模型实验也证明,在上述的低温置换(化学)固定过程中,有80%左右的激素分子被溶出组织块。因此对激素免疫定位的结果影响最大的是激素分子在组织内的位置移动,很显然这在低温置换过程中也是难以避免的。

③冰冻干燥和气体固定法

冻结材料的处理方法是冰冻干燥。如果环境的真空度低于在该温度下水的蒸汽压时,冰就不经过液态而直接气化,这一过程也称为升华。生物组织如果在其再结晶化点温度以下进行冻结干燥,细胞内的各种微细胞结构就不会遭到损伤,而且可以避免各种水溶性物质及离子之类的移动和流失。经冰冻干燥后的样品,在进行观察和作进一步的包埋和切片之前,需要对组织进行适当的固定。通常采用锇酸蒸汽对干燥材料进行气态固定。此外甲醛蒸汽可以固定IAA 和玉米素,碳二亚胺(DCC)蒸汽可以固定所有含羧基的酸性植物激素。这种将冻结干燥和气体固定相结合的方法称为冰冻干燥-气体固定法。利用这种方法可以制备与活体状态相近的样品材料。在细胞微细结果的观察、生物切片的放射自显影分析以及X 射线元素分析的实践中经常得到应用。在植物激素的固定中如果利用冻结干燥结合气体固定法,就可以避免上述溶液固定和低温置换固定法中溶剂处理的困扰,在一定程度上可以保证激素分子的原位性。

(2)植物激素的可视化标记

免疫组织化学定位技术的目标在于将定位与定量尽可能统一起来,这样使样本中发生的免疫学反应结果通过直观的方法充分表现出来。要做到上述要求,就必须选用合适的标记物。当前,利用放射性元素、酶、重金属标记的特异性抗体与激素之间灵敏而且专一的抗原抗体反应,能让我们很方便地在显微镜下观察到植物激素在组织甚至在细胞内的位置。近年来植物激素的免疫组织细胞化学定位研究中广泛采用的染色方法主要有以下几种。

①酶标记法

这是一种比较传统的免疫染色方法,包括直接法、间接法和PAP(过氧化物酶-抗过氧化物酶抗体复合物)法,其中PAP 法较为灵敏,能对抗原抗体反应连续起放大作用,所以被广泛地应用。

②荧光标记法

在免疫组织化学水平上,免疫荧光染色法操作比较简单,而且灵敏度也比酶标记法高,在非精细定位研究中可以得到比较理想的染色结果。常用的荧光标记物有异硫氰酸荧光黄(FITC)、罗达明B200以及异硫氰酸四甲基罗达明(TMRITC)。FITC 发黄绿色荧光,后两者均发橙红色荧光。将这两种荧光标记物相配合,就形成了对比荧光染色和荧光双标记技术。但是由于木质素与某些酚类物质也发黄绿色荧光,叶绿素则发红色荧光,此方法难以在绿色和木质化组织中应用。

③免疫金(银)染色法

在免疫染色方法中,免疫金(银)染色法是最灵敏的一种,尤其是在电子显微镜下观察有很大的优越性。因此是当今最受推崇的技术。而且利用免疫胶体金染色后的切片再用银增强染色后,还可用于光学显微镜下的观察。所以现在的植物激素的免疫化学定位研究绝大多数都采用了这种染色方法。其原理是先将氯金酸还原成颗粒直径不同的金融胶,用这种金融胶标记抗体或金黄色葡萄球菌A 蛋白,再将这种胶体金标记的抗体用于显微定位观察。由于胶体金是疏水的,并且在p H 高时带负电荷,很容易被抗体吸附在其表面而又不影响抗体的免疫活性。胶体金颗粒剂有很大的电子密度,在透射电镜下很容易被发现,若在光学显微镜下观察,胶体金颗粒直径应大于20 nm 才能被发现。这时可在金标抗体染色后,再用银显影处理,使金颗粒周围吸附大量的银颗粒。这样在光学显微镜下就很容易看到阳性部位呈现银离子的黑褐色。与其他标记物相比,胶体金更适合于一般实验室使用。在电子显微镜下胶体金颗粒的分布与数量可分别用作区域化定性和定量的依据。常规制备胶体金溶液的方法有柠檬酸钠-鞣酸还原法、柠檬酸钠还原法、白磷还原法和超声波还原法等。

以上概述了植物激素的免疫组织细胞化学实验里一些重要的问题以及现行的解决方法。除此之外,制备高特异性、高亲和性的抗体,设计周到的对照实验等,也都是植物激素的免疫组织细胞化学实验取得成功所必不可少的条件。