高效组织细胞培养技术助力植物生理研究

植物组织培养工作的全过程大致包括以下几个环节。

1.器皿的清洗

植物组织培养用的各种玻璃器皿特别是培养瓶和盛培养基的器皿,一定要严格清洗,以防油污、重金属离子、酸、碱等有害物质残留在瓶内,影响培养物的生长。

2.培养基的配制

培养基的选择对成功地进行植物组织培养至关重要,因此,在进行某项植物组织培养之前,应总结前人和本人工作中的经验教训,拟定出自认为较好的和有可能成功的培养基成分。

配制培养基是一项极细致的工作,不能有丝毫疏忽。在一般情况下,最好亲自动手,或交给熟练的技术人员配制。为了减少错漏,可印制一份配制培养基的成分单,然后按项按量加入,这样即使弄错,也可查找原因。

3.接种室用具消毒

接种室是进行无菌操作的地方,对其无菌要求是很严格的。用作接种室的房间,不管是在超净台上操作还是在一般台上操作,都要求室内洁净,空气中不带菌。因此,不仅在接种前要用紫外光灯照射20 min以上,而且要在用后或平时经常进行熏蒸(如用甲醛和高锰酸钾),或酒精喷雾、新洁尔灭等杀菌。超净台上最好安装紫外光灯。

4.材料灭菌

在接种前,必须使材料完全无菌,这是取得植物组织培养成功的根本保证。为了做到材料完全无菌,应从两个方面加以解决。

第一,要选取植物组织内部无菌的材料。这一方面要从健壮的植株上取材料,不要取有伤口的或有病虫的材料。另一方面要在晴天,最好是中午或下午取材料,绝不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。因为健壮的植株和晴天光合呼吸代谢旺盛的组织,有自身消毒作用,这种组织一般是无菌的。

第二,完全地杀死材料表面带有的各种微生物。表面消毒的基本要求是既要杀死材料表面的全部微生物,又要不伤害材料,这要根据不同材料,选用适当的消毒剂、合适的浓度和处理时间,灵活掌握使用。

5.无菌操作

植物组织培养是一种无菌技术,因此不仅要求整个操作过程、一切用具、材料、培养基、培养室、工作人员的衣物都要无菌,而且要求工作人员在操作过程中要遵守无菌操作规程,如稍有疏忽,都会造成无法挽回的恶果,使工作前功尽弃。

6.无菌培养(www.xing528.com)

植物组织培养是在人工控制的条件下进行的,对培养室的条件要求较严格,这些条件能否满足对成功至关重要。培养室的基本要求是:

(1)消毒灭菌

室内培养要做到无菌是困难的,因为常有人的进出,物品的进入,空气的交换等,会带入各种菌类。因此,即使经常消毒,也难保证无菌,事实上只能做到清洁少菌。为此,最好在室内装上紫外灯,定期开灯杀菌,也可用新洁尔灭喷洒灭菌。

(2)温度控制

植物细胞的生长发育和组织器官的分化,皆须在一定的温度下才能进行,因此培养室的温度一定要能周年控制,使其处在一定的昼夜温度或全日恒温下,以保证组织正常生长。培养室的温度一般保持在20~28℃下,最好有日夜温差,如白天26℃,晚上20℃,对植物生长有利。

(3)光照控制

组织培养物虽是异养生长,但其生长好坏和发育进程也往往受到光照的影响。当然,光照主要不是供给组织培养物以碳素营养,而是生长和分化的一种刺激因素或诱导因素。如葡萄的日照敏感品种培养物,仅在短日照下才能形成根,而日照不敏感品种培养物,在不同光周期下皆可形成根;长日照植物菊苣培养物,仅在长日照下才能形成花芽,而短日照植物紫雪花培养物,仅在短日照下才能形成花芽。

培养室内一般都采用日光灯,光强保持800~2 000 lx即可。光照时间的控制可用24 h定时器,自动控制12 h光照和12 h黑暗。对愈伤组织诱导培养往往需在黑暗下进行,因此最好有暗培养室。若无暗培养室,可用二层黑布盖住或隔开都可。

(4)湿度控制

组织培养中的湿度影响主要有两个方面,一是培养容器内的湿度,它的湿度条件常可保证100%;二是培养室的湿度,它的湿度变化随季节而有很大变动,往往是冬天因室内温度比室外高,结果室内湿度低,而夏天因室内温度比室外低,结果室内湿度高。湿度过高过低都是不利的:过低会造成培养基失水而干枯,或渗透压升高,影响培养物生长和分化;过高会造成杂菌滋长,导致大量污染。因此,要求室内常年保持70%~80%的相对湿度。其方法是可在冬天于加热器上放一盆水,并常拖地板,增加湿度。在夏天可用去湿器,或少开培养室的门。一般都很少对室内的湿度进行人工控制。

7.定期检查和细胞学观察

进行培养的材料,应定期检查,特别是接种后的3~7 d内,要每天检查,主要是检查其污染情况,发现污染材料,应及时处理掉。

一般每隔3~5 d都要进行观察,可用肉眼观察形态变化,也可用显微镜进行细胞学观察,如平板培养可进行定点观察,液体培养可用倒置显微镜进行观察,观察到的结果或值得记录的结果,应随时拍成照片,作为资料保存,并进行计数,以便统计分析。