植物生理研究技术：组织细胞培养设备及操作

1.洗涤设备

离体组织的培养对培养的用具要求较高,不仅其质地要好,对其清洁工作也有较高的要求,以防止一些有毒的或其他有害化学物质(如重金属离子、酸碱等)对培养物的不利影响。最大量的清洗工作是对玻璃培养瓶的洗涤,且要求较严。

有一定规模的组织培养室,必须有专用洗涤室,专门供辅助人员进行工作和贮藏洗净的培养瓶。洗涤室应设置大的二联洗涤池,工作台架,玻瓶晾干架,放培养瓶的架子和箱子,大型烘箱; 应有水桶,各种刷子等。

根据不同要求和器具的污物种类和程度,应选择适当的洗涤剂。可供选择的洗涤剂有:肥皂、洗衣粉、洗涤精、洗液和有机洗涤剂。

2.灭菌设备

植物组织培养中,凡用于培养和无菌操作的房间、器具、培养瓶、培养基、培养材料和操作者的衣物和手,都应随时进行灭菌,以确保不受杂菌污染。否则,由于杂菌的繁殖速度比细胞生长速度快,虽只有少量杂菌,但它在含有丰富养分的培养基中能迅速增殖,2~3 d内就发生严重污染。所以,无菌设备是进行植物组织培养不可缺少的关键设备。灭菌设备依采用灭菌的方法不同而区分。

(1)灭菌种类

灭菌有两种类型:物理灭菌和化学灭菌。

物理灭菌有:高温高压灭菌、干热灭菌、射线辐照灭菌、过滤除菌。

化学灭菌有:熏蒸灭菌、消毒液灭菌(酒精、氯化汞、苯酚、漂白精、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢)。

(2)灭菌方法

①高温高压灭菌法

将需要灭菌的物品放在一密封的高温高压灭菌锅内,在121℃高温和每平方厘米为5个大气压的压力下,一般持续15~20 min后,就可杀死一切微生物的营养体及其孢子。适于器皿、工具、衣物和培养基灭菌。

②干热灭菌法

将物品放入烘箱,利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的目的。适用于玻璃器皿。

③过滤除菌法

将带菌的液体或气体通过孔径小于0.45μm 微孔滤器装置,使杂菌受到阻隔留在滤板上而液体或气体进入无菌空瓶内,从而达到除菌目的,此法常用于不能以高温高压灭菌的培养液、有机物质溶液和酶液的除菌,以及超净台空气除菌。组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜过滤器,它清洗方便,过滤效果好。

④射线灭菌法

紫外光常用于无菌室、培养室和接种箱内的灭菌。在室内装上紫外光灯,操作前开灯20 min可达到灭菌效果。紫外光会伤害人的眼睛,故绝不可在紫外光下操作,紫外光的穿透力差,3~5 mm 厚的玻璃能阻挡紫外光,保护人的眼睛。

⑤熏蒸灭菌法

用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌,适用于无菌室的定期灭菌。常用的方法是将甲醛和高锰酸钾混合后,产生大量蒸汽,以杀死微生物,效果较好。

⑥化学灭菌法

依化学灭菌剂的不同而适用于不同场合灭菌。70%酒精几乎适用于组织培养中的各种灭菌,如各种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、工作台、操作人员的手等。漂白粉、次氯酸钙(或钠)、氯化汞、新洁尔灭、过氧化氢、抗菌素等适于培养材料的灭菌。所用浓度、消毒时间,因不同材料而定,应灵活运用,总结经验。

3.化学实验设备

植物细胞和组织培养所需器具的洗涤、干燥和保存,培养基的配制分装和灭菌,化学试剂的配制,重蒸馏水的生产,接种材料的制备和生理生化的分析等操作,都可在一间配置适当的综合化学实验室内进行。

4.无菌操作设备(www.xing528.com)

操作时可根据需要和可能选用下列诸种设备,都可取得良好效果。

(1)无菌室

供外植体的接种、培养物的转移和原生质体的游离培养操作之用。要求用紫外光灯灭菌后,能较长时间保持无菌状态。无菌室的建造要求严格,除出入口和通气口外,应当密闭。

(2)超净台

普遍在超净台上进行无菌操作,有无菌效果好,使用方便,操作人员舒适等优点。把它放在较清洁的房间内即可使用。

(3)接种箱

最简易的办法是用无菌箱,它对继代转接和微生物操作的无菌效果较好。接种箱的上、前两侧均为玻璃,前面有两个圆孔,装有布袖套。箱内装有紫外光灯和日光灯。

(4)超净室

由专用厂生产的组合式超净室,无菌效果好,操作方便舒适,但价格昂贵,非一般实验能用。其工作原理是,由一侧(边侧或前侧)向封室内压入过滤除菌的净化空气,另一侧抽出带菌的空气,使室内经常保持无菌状态。

(5)接种工具

可根据需要选医疗和微生物实验室使用的工具。

5.培养设备

(1)培养箱室

它是离体组织和试管苗生长发育的场所,相当于作物的生长场所——大田。因此,应为培养物创造适宜的温、光、水、气等条件。

①培养室。室内要求内壁保温和涂以油漆,具有磨光水泥的或油漆过的地板,顶高以2.6 m 为宜,易于控制温湿度,窗户上要装双层密封玻璃窗。有窗户虽对保温保湿不利,但有自然光射入,对苗的生长和无菌有好处。室内要有足够的电源。

室内要保持清洁,定期用20%新洁尔灭消毒,防止杂菌生长。

②培养箱。供组织培养用的培养箱有各种类型,主要有:

A.调温培养箱。供暗培养之用,即普通温箱。

B.调温调湿培养箱。供暗培养之用,可防止培养基干枯。

C.光照培养箱。供光照培养之用。用于分化培养和试管苗生长之用。有可调湿和不可调湿的功能之分。

③人工气候箱室。可以程序控制的全自动的调温调湿控光的人工气候装置。小的称人工气候器,中的称人工气候箱,大的称人工气候室。用于组织和细胞培养,以人工气候器为佳,它可放在工作室中使用。

(2)培养容器

培养用的玻璃器皿种类规格繁多,根据条件和需要可采用各种玻璃瓶皿作培养容器,现在已开始采用一次性使用的透明聚乙烯培养容器。

6.细胞学观察设备

在植物细胞和组织培养过程中,需随时观察和记录其细胞学和形态解剖学的变化,故要进行显微观察、显微和普通摄影、组织切片、细胞染色等工作。因此,细胞学实验室应由三个小间(室)组成,即进行一般操作间(如切片、染色和材料准备等)、显微镜观察间和暗室。