植物线粒体制备：困难与解决方案

1.线粒体制备的基本要求

线粒体是植物细胞的重要细胞器,是进行生物氧化、提供能量的场所。其结构及变化与多种生命现象有关。植物线粒体一般直径为0.5~1.0μm,长3μm。其沉降系数为(1~1.7)×104S。通常用差速离心技术进行分离。也可以进一步采用密度梯度离心进行纯化。用差速离心分离时,其离心力(g)和离心时间随植物材料而异。一般先用低速(500~1 000×g)短时间(5~15 min)去除细胞碎片,然后再11 000~20 000×g沉降线粒体。

制备植物线粒体最大的困难是组织结构破碎常伴随线粒体膨胀,以及内源脂肪酸、酚类、醌类物质引起正常线粒体功能的抑制。因此,在制备线粒体时有下列要求。

(1)溶液系统必须维持一定的渗透压,避免线粒体膨胀而破裂。

(2)加EDTA 等螯合剂或巯基化合物以降低或去除酚类化合物的毒害作用。

(3)加入1 mg·m L-1的牛血清白蛋白(BSA)抵抗游离脂肪酸或其他脂类物质的毒害。

(4)根据不同的植物材料,确定一个合适的缓冲系统,维持一定的p H。

2.植物材料的选择

制备线粒体最好采用黄化的幼苗或贮藏组织,应避免使用组织坚硬、细胞壁老化及含叶绿体的材料,而且要求材料新鲜,生长旺盛。

(1)分离介质和保存介质

①分离介质:包括渗透剂、缓冲系统和线粒体保护物质。常用的缓冲系统有磷酸盐系统、Tris-HCl系统和HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸)系统等。p H 值一般维持在7.4左右。常用的渗透剂包括甘露醇和蔗糖,在分离介质中加入渗透剂的目的是保持渗透平衡,避免线粒体膨胀而破裂。保护物质主要包括EDTA 等螯合剂、巯基化合物和牛血清白蛋白(BSA)等,以降低或去除酚类化合物对线粒体的毒害作用,抵抗游离脂肪酸或其他脂类物质对线粒体的毒害,维持线粒体的正常功能。(www.xing528.com)

②保存介质:保存介质常用含有0.3 mol·L-1甘露醇的缓冲液。

③操作环境:在制备线粒体过程中,必须在0~4℃低温条件下进行,而且要求动作迅速,1.5 h内完成全过程,以避免线粒体老化。分离后的线粒体应该保存在专门的保存介质中。

(2)线粒体的分离和纯化

①线粒体的分离:选择植物材料→匀浆→4层纱布过滤→滤液→低速离心→分离上清液→高速离心→分离(沉淀即为粗制线粒体)→纯化。

②线粒体的纯化:纯化线粒体可采用反复差速离心技术,按照下列步骤进行。

粗制线粒体→再悬浮→高速离心(20 000×g,40 min)→沉淀(重复操作2~3次)→沉淀(纯化线粒体)→悬浮在保存介质中,0~4℃下保存备用。

(3) 线粒体的活性鉴定

①詹纳斯绿B染色液:詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞碱性染料,解离后带正电,线粒体膜则带负电,由于电性吸引而堆积在线粒体膜上。存在于线粒体膜上的细胞色素氧化酶可使该染料保持在氧化状态而呈蓝绿色。而在细胞质中则被还原为无色。可以用光学显微镜进行粗略的观察。也可以经磷钨酸负染后,用电子显微镜观察线粒体结构的完整性和杂质的污染情况。

②呼吸速率的测定:线粒体的呼吸耗氧量可用氧电极法或微量减压法测定。此外,还可以测定线粒体上的标志酶活性,如细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶等酶的活性。