（一）材料与方法
1.蚯蚓致死率
这里使用的指示生物为赤子爱胜蚓（Eisenia fetida），平均体长为（8±0.5）cm，平均体重为（6.0±0.25）g。
待土壤稳定化处理7 d后（期间添加适量水，保持土壤含水率），将育好的蚯蚓置于湿润的滤纸上进行清肠24 h，清肠结束后用生理盐水将蚯蚓表面冲洗干净，将其放入土壤中，每个花盆放入40条蚯蚓，分别在第1、3、7、14、21、28 d查看其死亡数量。
2.蚯蚓回避率
所用测试培养皿为20 cm×10 cm×7 cm透明塑料盒。首先用一块大小合适的挡板插在塑料盒中部，分别在挡板两侧放入500 g（干重）已湿润的对照土壤与不同浓度污染土壤，用玻璃棒将土壤表面整平并使两个分室中土壤高度相同，将挡板轻轻抽出，在塑料盒中间留下一道近0.5 cm宽的缝隙。将10条已清肠的成熟蚯蚓轻轻放入缝隙中（头部不朝向任何一侧土壤）。用医用纱布和橡皮筋将塑料盒封口以防止蚯蚓逃逸和保证蚯蚓正常呼吸，塑料盒置于培养室内，温度为（22±1）℃，光照周期为12 h（光照）∶12 h（黑暗）。培养48 h后将挡板沿原先中间缝隙位置插入，以阻断蚯蚓在对照土壤和污染土壤之间的自由迁移，分别计数对照和污染土壤中的蚯蚓数目，若蚯蚓被插入的挡板截为两段，则被计入头部指向一端的土壤。整个实验流程如图4-6所示。
式中 C——对照组蚯蚓的总条数;
T——污染组蚯蚓的总条数;
N——加入土壤中的蚯蚓总数。
图4-6 蚯蚓回避实验的二室型装置
当NR大于80%时，则表明蚯蚓有明显的回避反应，该土壤不适合蚯蚓生存;当NR为负数，表明蚯蚓无回避反应。
3.蚯蚓体重损失
每个花盆中放入500 g干重土壤，土壤含水率保持35%，土壤样品分为稳定化处理和未稳定化处理两组，每组设三个平行。取20条清肠24 h的成熟蚯蚓，在放入土壤之前称量蚯蚓鲜重，取平均数。分别在暴露的第3、7、14、21、28 d取出蚯蚓，清肠24 h，记录蚯蚓的数量，擦去表面水分后称量蚯蚓鲜重，取平均数。蚯蚓的体重损失用相对体重损失率（relative weight loss rate）表示：
式中 W0——培养前蚯蚓鲜重，mg;
Wt——培养t d后蚯蚓鲜重，mg。
4.蚯蚓生物累积
分别称取土壤样品500 g于六组小花盆中，其中三组进行土壤稳定化处理，待土壤养护7 d后（添加一定量水以保证土壤的含水率），将具有生殖环带的蚯蚓置于经去湿润的滤纸上进行清肠24 h，清肠结束后用生理盐水将蚯蚓表面冲洗干净，将其暴露于土壤中，分别在第3、7、14、21、28 d各取5～6条蚯蚓，再次清肠24 h。清肠结束后用生理盐水将蚯蚓表面冲洗干净，将其冷冻干燥后研磨至粉末状。
采用火焰原子吸收光谱仪（AAS）对样品中的Pb含量进行检测。准确称取蚯蚓样品0.2 g于消解管中，采用王水进行消解，即加入6 ml盐酸、2 ml硝酸，盖上盖子，拧紧，放入微波消解仪中进行消解。待消解结束后，取出消解管，将消解管内的液体转移至坩埚中使用电加热板150℃进行赶酸。样品倒入坩埚后，根据情况再次加入一定量的王水进行赶酸，当白烟冒尽且消解物呈黏稠状时，取下稍冷，用水冲洗坩埚盖及内壁，并加入1 mL盐酸溶液温热溶解残渣，然后全量转移至10 mL容量瓶中定容，放入4℃冰箱冷藏保存。
使用高效液相色谱（HPLC）与电感耦合质谱（ICP-MS）联用进行砷形态分析。称取0.1 g样品转移至PTFE微波消解管中，向容器中加入10 mL超纯水。样品5 min内加热到75℃并保持10 min，冷却至室温后，定容至25 mL，11 000 r／min离心5 min。使用0.22μm水相滤膜过滤，于4℃下避光保存，并于48 h内完成分析。
5.蚯蚓抗氧化酶活性
1）蚯蚓匀浆缓冲液的配制
表4-4为配置蚯蚓匀浆缓冲液的配方，配置好后调节溶液pH值至7.5，4℃保存备用。
表4-4 蚯蚓匀浆缓冲液成分
2）蛋白质含量测定液的配制
（1）蛋白质标准液的配制。以小牛血清蛋白（BSA）为标准蛋白，准确称取150 mg牛血清白蛋白于100 mL容量瓶中，加超纯水定容，即为1 500μg／mL的原液。
（2）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂的配制。准确称取100 mg考马斯亮蓝G-250于50 mL 90%乙醇中，加入85%的磷酸100 mL，用超纯水定容至1 000 mL。常温下此溶液可放置一个月。
3）蚯蚓粗酶液的制备
将清肠后的蚯蚓用超纯水洗净，用滤纸擦干，准确称量组织重量，置入10 mL玻璃匀浆器中，按重量（g）∶体积（mL）=1∶19的比例加入19倍体积的蚯蚓匀浆缓冲液。冰浴条件下充分匀浆，制备成5%的组织匀浆，之后转移至10 mL离心管中，2 500 r／min离心10 min，置于冰水浴中待测。
4）蛋白质含量的测定
蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法。蛋白质分子含有
基团，当考马斯亮蓝显色剂加入蛋白质标液或者样品中时，考马斯亮蓝染料上的阴离子与蛋白质上的
结合，使溶液变为蓝色。蛋白质和色素的结合物在595 nm波长下有最大吸收值。
5）超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定
黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统可产生超氧阴离子自由基，自由基氧化羟胺可形成亚硝酸盐，并在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，其对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值会低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。
（1）试剂组成。
试剂一：储备液，10 mL液体1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）。试剂一应用液的配制：用时每瓶10 mL储备液加双蒸水稀释至100 mL，4℃保存1年。
试剂二：10 mL液体1瓶，4～10℃保存1年。
试剂三：10 mL液体1瓶，4～10℃保存1年。
试剂四：储备液，2支350μL，4℃保存，不可冷冻;4号稀释液，1瓶10 mL，4℃保存6个月。试剂四应用液的配制：用时按储备液∶稀释液=1∶14比例配制，用多少配多少，4℃保存，不可冷冻。
试剂五：1支粉剂，用时加70～80℃热双蒸水75 mL溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用双蒸水补充至75 mL，配好后的试剂避光4℃冷藏1年。
试剂六：1支粉剂，用时加双蒸水75 mL溶解后备用，配好后试剂避光4℃冷藏保存6个月。
显色剂的配制：按试剂五∶试剂六∶冰乙酸=3∶3∶2的体积比配制，用多少配多少，配好的显色剂4℃避光冷藏3个月。
冰醋酸为分析纯。
（2）操作方式。SOD活性测定参照试剂盒说明，按表4-5进行操作。
表4-5 SOD活性测定
用漩涡混合器混匀，室温放置10 min，于波长550 nm处，1 cm比色皿，双蒸水调零比色。
（3）计算方法：
6）过氧化氢酶（CAT）活性的测定
每毫升血清或血浆每秒钟分解1μmol过氧化氢的量即为一个活力单位。
（1）试剂组成。
试剂一：100 mL液体1瓶，4℃保存6个月。
试剂二：10 mL底物液体1瓶，4℃保存6个月。
试剂三：1瓶显色粉剂，4℃保存6个月。加双蒸水至100 mL溶解，4℃保存1个月（如果底部有不溶粉末沉淀，直接取上清使用，不影响测定结果）。
试剂四：10 mL液体1瓶，4℃保存6个月。天冷时会凝固，临用前37℃水浴至透明方可使用。
（2）操作方式。CAT活性测定参照试剂盒说明，按表4-6进行操作。
表4-6 CAT活性测定
用漩涡混匀器混匀，波长405 nm，光径0.5 cm，双蒸水调零，测定各吸光度值。
（3）计算方法：(www.xing528.com)
（二）结果与讨论
1.稳定化前后蚯蚓致死率变化
1）Pb污染土壤
稳定化处理前后Pb污染土壤中蚯蚓死亡个数见表4-7。根据蚯蚓的死亡情况，计算蚯蚓的致死率（表4-8和图4-7）。
表4-7 稳定化处理前后Pb污染土壤中蚯蚓死亡个数记录
续表
注：MN代表未稳定化处理实验组;MS代表稳定化处理后的实验组。
表4-8 稳定化处理前后铅污染土壤对蚯蚓致死率的影响
图4-7 Pb污染土壤稳定化处理前后对蚯蚓致死率的影响
（MN代表未稳定化处理的实验组;MS代表稳定化处理的实验组）
由蚯蚓的致死率结果可知，稳定化后的土壤中蚯蚓的死亡率明显低于未稳定化的土壤。在未添加稳定剂的土壤中，蚯蚓在第一周内死亡率急剧升高至52.5%，随后趋于平缓，最终达到55%;在添加稳定剂的土壤中，蚯蚓在第一周未出现死亡，随着暴露时间的延长，出现少量死亡，但死亡率较低，仅为7.5%。
赵学平使用人工土壤法测定Pb污染土壤对蚯蚓致死率的影响，结果表明，Pb对蚯蚓的最低致死浓度为2 163 mg／kg。蚯蚓接触含有重金属的土壤后，有出血现象，周围土壤可见明显红染;环带肿大，有黄色液体渗出，身体萎缩、糜烂，体节有断裂现象。宋玉芳将蚯蚓暴露在单一Pb污染和Pb、Zn、Cu及Cd复合污染土壤，Pb浓度为1 700 mg／kg时，蚯蚓出现死亡现象，复合污染土壤比单一金属对蚯蚓的毒性更强。该污染土壤属于多种重金属的复合污染，其中Pb含量为1 560 mg／kg，pH值为7.85。该实验中致死率高于文献所报道的结果，可能是因为该实验所用土壤为场地污染土壤，重金属污染情况复杂，土壤中含有多种重金属，重金属的相互作用导致更强的毒性。Ravi Naidu通过实验证实，多种重金属共存可导致蚯蚓致死率升高。
2）As污染土壤
表4-9 稳定化处理前后As污染土壤对蚯蚓致死率的影响
由表4-9和图4-8可知，暴露第7 d时，稳定化处理前后的土壤中蚯蚓均未出现死亡。随着暴露时间的延长，未稳定化处理的土壤中，蚯蚓致死率明显升高，且在暴露的第28 d时达到80%。稳定化处理的土壤中，蚯蚓出现了少量的死亡，在暴露第28 d时仅为16.7%，远远低于未稳定化处理的土壤中蚯蚓的致死率。说明稳定化药剂能够较好地降低重金属对蚯蚓的生物有效性。
图4-8 As污染土壤稳定化前后对蚯蚓致死率的影响
图4-9 Cd污染土壤稳定化前后对蚯蚓致死率变化
3）Cd污染土壤
图4-10 重金属污染胁迫下赤子爱胜蚓的回避率
稳定化处理前，蚯蚓随着暴露时间的延长，致死率逐渐升高。至暴露第四天，蚯蚓全部死亡。稳定化处理后，蚯蚓在暴露的第一天致死率达到65%，第二天全部死亡。稳定化处理后蚯蚓的致死率远高于稳定化处理前（图4-9）。
2.稳定化前后蚯蚓回避率变化
对于Pb污染土壤，蚯蚓对原始污染土壤在0 h产生40%的回避率，在48 h有60%的回避率，稳定后的土壤产生了明显的归趋现象;对于As污染土壤，蚯蚓对原始污染土壤在0 h产生10%的回避率，在48 h回避率为负数，表明蚯蚓无回避反应（图4-10）。
3.稳定化前后蚯蚓体重损失变化
1）Pb污染土壤
Pb污染土壤经稳定化处理后，蚯蚓的体重在14 d增长率为18.4%;未稳定化处理的Pb污染土壤中，蚯蚓表现为体重持续下降趋势，即相对体重损失率持续上升（图4-11）。
2）As污染土壤
如图4-12所示，暴露第3 d，稳定化处理后的土壤中蚯蚓的相对体重损失率为-1.97%，即蚯蚓体重升高。随着暴露时间延长，蚯蚓体重逐渐降低。直至暴露的第28 d，蚯蚓的相对体重损失率为29.37%。在未进行稳定化处理的土壤中，蚯蚓体重损失随着暴露时间的延长逐渐增大，经过28 d的暴露，蚯蚓的体重损失率增大到33.02%。稳定化处理前蚯蚓的体重损失大于稳定后蚯蚓的体重损失，表明稳定化处理可降低土壤中As对蚯蚓的生物有效性。
图4-11 稳定化处理前后Pb污染土壤中蚯蚓的相对体重损失率
图4-12 稳定化处理前后As污染土壤中蚯蚓的相对体重损失率
图4-13 稳定化处理前后Pb污染土壤对蚯蚓生物累积的影响
4.稳定化前后蚯蚓生物累积变化
1）Pb污染土壤
如图4-13所示，在未稳定化的Pb污染土壤中，蚯蚓体内Pb富集的含量明显高于稳定化后的Pb污染土壤中蚯蚓体内Pb的含量，说明对Pb污染土壤进行稳定化处理可有效降低Pb对蚯蚓的生物有效性。随着暴露时间延长，蚯蚓体内Pb的含量不断升高，说明蚯蚓对Pb存在明显的富集作用。此结果与前人研究相似。
2）As污染土壤
稳定化处理前后，蚯蚓体内三价砷和有机砷含量随着暴露时间的延长逐渐升高，蚯蚓体内三价砷含量在稳定化前高于稳定化后（图4-14）。
5.稳定化前后蚯蚓抗氧化酶活性变化
1）超氧化物歧化酶（SOD）活性
如图4-15、图4-16所示，机体受到氧化胁迫时，抗氧化酶可以被激活从而使机体有效抵抗氧化胁迫。但严重的氧化胁迫可能促使机体大量产生活性氧自由基，抑制抗氧化酶的活性。As污染土壤稳定前后，蚯蚓体内的超氧化物歧化酶在7 d时出现较强的抑制。Pb污染土壤稳定前，蚯蚓体内的SOD在7 d时有较强的抑制，随着时间延长，14 d时Pb对存活蚯蚓的影响呈现减弱的趋势;Pb污染土壤稳定后在整个周期内基本与对照相同，在14 d时呈现了微弱的抑制现象，可能是随着蚯蚓暴露时间的增长，体内的抗氧化酶被激活。
图4-14 稳定化处理前后As污染土壤对蚯蚓生物累积的影响
图4-15 As胁迫下蚯蚓体内SOD活性变化
图4-16 Pb胁迫下蚯蚓体内SOD活性变化
2）过氧化氢酶（CAT）活性
如图4-17、图4-18所示，As污染土壤稳定化前后，蚯蚓体内的CAT在14 d内均先抑制后增强，说明As在初期对蚯蚓体内酶活的影响较为显著。Pb是没有生物学功能的有毒重金属，但它可以模仿诸如Ca、Fe、Zn等在生物学上具有非常重要功能的金属离子进入生物体内。Pb污染土壤稳定化后，其对蚯蚓体内的过氧化氢酶有较强的氧化胁迫，随着时间的增长影响逐渐消失，说明稳定化后土壤的毒性在蚯蚓自我防御能力内。
图4-17 As胁迫下蚯蚓体内CAT活性变化
图4-18 Pb胁迫下蚯蚓体内CAT活性变化
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