微生物指示评估重金属生物有效性

微生物是土壤生态系统的重要组成部分。研究发现，在重金属污染土壤中，随着土壤重金属含量的增加，土壤微生物生物量碳逐渐降低，其与土壤中重金属有效态含量呈显著相关;土壤中重金属含量会影响微生物群落结构的组成和功能多样性，微生物对单一碳源的利用能力也会降低。Kelly等对重金属污染土壤进行修复后，通过分析修复后的微生物群落来表征修复效果，结果表明，与未修复的重金属污染土壤相比，修复后的土壤中真菌、放线菌和革兰氏阳性菌增加，表明修复有助于土壤中微生物种群的恢复。微生物的变化可反映土壤中重金属的污染状况，因此可通过微生物的指示作用评估土壤中重金属的生物有效性。

过去研究中，常用土壤微生物生物量、ATP含量、土壤代谢熵、土壤酶活性等指标来表征土壤重金属污染的生物学效应。Ivask等以两种萤火虫荧光酶素细菌组合监测了污染土壤Cd和Pb的生物有效性，发现Cd和Pb的生物有效性与土壤类型有较大相关性。随重金属污染程度的不同，土壤微生物数量、微生物生物量C和N的量会产生相应的变化，因此可以建立这些指标与重金属有效性的相关性。如低浓度的Cd、Zn、Cu、Pb复合污染可刺激土壤中细菌、真菌、放线菌、微生物生物量C和N的数量，但高浓度的Cd、Zn、Cu、Pb复合污染可导致土壤中细菌、真菌、放线菌、微生物生物量C和N均显著下降;重金属Cd、Zn、Cu、Pb之间存在着一定的协同或拮抗作用，Cd、Zn、Cu和Pb在微生物生物量C和N上表现出明显的协同效应，Pb与Cd、Zn、Cu对细菌数量的复合效应机制为拮抗效应，Cd、Zn、Cu和Pb对真菌数量和放线菌数量的复合效应机制表现为协同效应和拮抗效应并存。Liao等的研究发现，非致病的绿色荧光蛋白是一种基于细菌生物传感器，具有高灵敏、价廉、实用的特点，能较好地反映出土壤／沉积物重金属的生物有效性。

由于不同土壤中微生物区系结构和数量有差异，对重金属的敏感程度各异、专一性差（比如对有机污染物也有响应），造成不同土壤的研究结果之间无可比性。其后，一些基于单一菌株（例如发光菌或真菌）的荧光性或特异性酶活性的金属毒性测试技术（如Microtox、Metolate等）被成功应用到污染物的毒性评价中，促进了微生物法的应用。如通过测定内生菌根真菌的孢子萌发来检测土壤重金属污染。用生态毒性剂量值（Eco-toxicological Dose）定量研究污染物对微生物过程的影响，确定影响重金属毒性的因素及对重金属污染最为敏感的土壤微生物学或生物化学性质。近年来，一些现代分子生物学检测方法也被引入污染土壤重金属的生物评价中，但由于这些方法尚处探索之中且所需设备昂贵。传统的微生物测试虽然快捷，但测试结果易受到污染物之外的其他因素干扰，微生物的变化也与土壤有机碳、pH值相关，而且由于土壤各影响因素之间的相互作用影响太大，难以判断是什么因子引起微生物性质的改变，因此微生物方法尚未能得到普及。

土壤微生物群落结构是表征土壤生态系统群落结构和稳定性的重要参数之一，能够反映土壤环境质量的变化过程。微生物群落结构多样性研究中，较常用的方法是平板计数法和稀释频度法。此外，现代分子生物学通过分析不同DNA分子的种类及其数量来反映微生物的种群结构，主要包括群落水平总DNA分析方法、核酸杂交技术、克隆文库方法和基因指纹技术等。自20世纪70年代以来，研究者在土壤重金属污染对微生物群落结构多样性的影响方面开展了大量研究。通过污染大田测定、盆栽和模拟试验，大部分研究结果表明，重金属对微生物的毒性效应与其浓度有很大关系，低浓度的某些重金属能够促进微生物生长，但随着重金属浓度增加，会出现明显的抑制作用，两者一般呈负相关，其相关显著性与重金属种类、土壤类型及微生物类群有关。此外，不同微生物区系对重金属的敏感程度不同，其敏感性顺序一般为细菌＞放线菌＞真菌，且重金属对微生物的毒性受许多因素的影响和制约，其中以土壤质地、pH值等影响最大。(www.xing528.com)

土壤微生物不但是土壤肥力的主要标志，也可对土壤的生态毒性进行评估。如重金属能抑制反硝化细菌的活动，减少土壤氮素的损失，也可抑制固氮菌、根瘤菌等有益微生物的生存，从而影响土壤环境的正常功能。常见测定土壤微生物的方法很多，如土壤呼吸强度、土壤氨化作用和硝化作用强度、土壤酶活测定等。

发光菌实验利用明亮发光细菌（Photobactrium phosphoreum）在受到外界因素的影响时，发光过程中产生的发光强度会与污染物浓度或毒性作用强度之间呈剂量-反应线性相关，以此评价污染物毒性。1998年，国际标准化组织颁布了发光细菌毒性检测技术（LBT）的标准方法，常用的评估标准有：法国的DIN 38412—1990、美国的ASTM D5660—1995、我国的《水质 急性毒性的测定 发光细菌法》（GB／T 15441—1995）及欧盟的EN ISO 11348。目前采用LBT技术评估重金属污染土壤稳定化处理后浸出液的毒性日益受到关注，具有检测时间短、灵敏度高等优势。