（一）实验目的和要求
（1）掌握用稀释与接种法测定五日生化需氧量（BOD5）的基本原理和方法。
（2）熟悉溶解氧（DO）的测定方法。
（二）实验原理
生化需氧量（BOD）是指在规定条件下，微生物分解存在于水中的某些可氧化物质，特别是有机物所进行的生物化学过程中消耗的溶解氧的量，用以间接表示水中可被微生物降解的有机物的含量，是反映有机物污染的重要类别指标之一。测定BOD的方法有稀释与接种法、微生物电极法、活性污泥曝气降解法、库仑滴定法、压差法等。本实验采样稀释与接种法测定BOD5。
该方法是将水样充满完全密闭的溶解氧瓶，在（20±1）℃的暗处培养5d，分别测定培养前后水样中溶解氧的质量浓度，其差值即为所测样品的BOD5，以氧的mg/L表示。
对某些地表水及大多数工业废水，因含有较多的有机物（BOD5大于6mg/L），需要稀释后再培养测定，以降低其浓度和保证有充足的溶解氧。稀释的程度应使培养中所消耗的溶解氧大于2mg/L，而剩余溶解氧在2mg/L以上。为了保证水样稀释后有足够的溶解氧，稀释水通常要通入空气（或通入氧气）进行曝气，使稀释水中溶解氧接近饱和。稀释水中还应加入一定量的pH缓冲溶液和无机营养盐（磷酸盐，钙、镁和铁盐等），以保证微生物生长的需要。
对于少含或不含微生物的工业废水，其中包括酸性废水、碱性废水、高温废水或经过氯化处理的废水，在测定BOD5时应进行接种，以引入能分解废水中有机物的微生物。当废水中存在着难以被一般生活污水中的微生物以正常速率降解的有机物或含有剧毒物质时，应将驯化后的微生物引入水样中进行接种。
（三）实验仪器与试剂
1.仪器
（1）恒温培养箱 带风扇。
（2）溶解氧瓶 带水封，容积250～300mL。
（3）稀释容器 1000～2000mL量筒。
（4）冰箱 有冷藏和冷冻功能。
（5）虹吸管 供分取水样和添加稀释水用。
（6）曝气装置 空气应过滤清洗。
（7）滤膜 孔径1.6μm。
2.试剂
除另有说明外，所用试剂均为分析纯试剂。
（1）磷酸盐缓冲溶液 将8.5g磷酸二氢钾（KH2PO4）、21.8g磷酸氢二钾（K2HPO4）、33.4g七水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·7H2O）和1.7g氯化铵（NH4Cl）溶于水中，稀释至1000mL。此溶液的pH为7.2。
（2）硫酸镁溶液 将22.5g七水合硫酸镁（MgSO4· 7H2O）溶于水中，稀释至1000mL。
（3）氯化钙溶液 将27.6g无水氯化钙溶于水，稀释至1000mL。
（4）氯化铁溶液 将0.25g六水合氯化铁（FeCl3·6H2O）溶于水，稀释至1000mL。
（5）盐酸（0.5mol/L）将40mL（ρ=1.18g/mL）盐酸溶于水，稀释至1000mL。
（6）氢氧化钠溶液（0.5mol/L）将20g氢氧化钠溶于水，稀释至1000mL。
（7）亚硫酸钠标准溶液[c（1/2Na2SO3）=0.025mol/L]将1.575g亚硫酸钠溶于水，稀释至1000mL。此溶液不稳定，需当天配制。
（8）葡萄糖—谷氨酸标准溶液 将葡萄糖（C6H12O6，优级纯）和谷氨酸（HOOC—CH2—CH2CHNH2—COOH，优级纯）在103℃烘干1h后，各称取150mg溶于水中，移入1000mL容量瓶内并稀释至标线，混合均匀，此标准溶液临用前配制。
（9）稀释水 在5～20L玻璃瓶内装入一定量的水，控制水温在20℃左右，曝气至少1h，使水中的溶解氧接近饱和（8mg/L以上），也可以鼓入适量纯氧。瓶口盖以两层经洗涤晾干的纱布，置于20℃恒温培养箱中放置数小时，使水中溶解氧含量达8mg/L左右。临用前于每升水中加入氯化钙溶液、氯化铁溶液、硫酸镁溶液、磷酸盐缓冲溶液各1.0mL，并混合均匀。稀释水的pH应为7.2，其BOD5应小于0.2mg/L。
（10）接种液 可选用以下任一方法获得适用的接种液：
①生活污水：一般将生活污水（COD不大于300mg/L，TOC不大于100mg/L）在室温下放置一昼夜，取上层清液供用。
②含生活污水的河水或湖水。
③污水处理厂的出水。
④驯化接种液：当分析含有难降解物质的废水时，在排污口下游3～8km处取水样作为废水的驯化接种液。也可取中和或经适当稀释后的废水进行连续曝气，每天加入少量该种废水，同时加入适量生活污水，使能适应该种废水的微生物大量繁殖。当水中出现大量絮状物时，表明适用的微生物已进行繁殖，可用作接种液。一般驯化过程需要3～8d。
（11）接种稀释水 取适量接种液，加于稀释水中，混匀。每升稀释水中接种液加入量为：生活污水1～10mL，河水、湖水10～100mL。接种稀释水的pH应为7.2，BOD5应小于1.5mg/L。接种稀释水配制后应立即使用。
（12）丙烯基硫脲硝化抑制剂 溶解0.2g丙烯基硫脲（C4H8N2S）于200mL水中，4℃保存。
（四）测定步骤
1.水样的预处理
（1）水样的pH若不在6～8，可用盐酸或氢氧化钠稀溶液调节。
（2）水样中含有铜、铅、锌、镉、铬、砷、氰等有毒物质时，可使用含驯化接种液的接种稀释水进行稀释，或提高稀释倍数，降低毒物的浓度。
（3）含有少量游离氯的水样，一般放置1～2h，游离氯即可消散。对于游离氯在短时间不能消散的水样，可加入亚硫酸钠溶液以除去。其加入量的计算方法：取中和好的水样100mL，加入（1+1）乙酸10mL、100g/L碘化钾溶液1mL，混匀。以淀粉溶液为指示剂，用亚硫酸钠标准溶液滴定游离碘。根据亚硫酸钠标准溶液消耗的体积及其浓度，计算水样中所需加亚硫酸钠溶液的量。
（4）从水温较低的水域或富营养化的湖泊采集的水样，可能含有过饱和的溶解氧，此时应将水样迅速升温至20℃左右，充分振摇，以赶出过饱和的溶解氧。从水温较高的水域或废水排放口取得的水样，则应迅速使其冷却至20℃左右，并充分振摇，使之与空气中氧分压接近平衡。
（5）水样中含有大量藻类时，BOD5测定结果会偏高，因此采用孔径为1.6μm的滤膜过滤。
2.水样的测定
（1）不经稀释水样的测定 溶解氧含量较高、有机物含量较少的地表水，可不经稀释，而直接以虹吸法将约20℃的混匀水样转移至两个溶解氧瓶内，转移过程中应注意不使其产生气泡。以同样的操作使两个溶解氧瓶充满水样后溢出少许，加塞水封。瓶内不应有气泡。若水样中含有硝化细菌，需在每升水样中加入2mL丙烯基硫脲硝化抑制剂。立即测定其中一瓶溶解氧。将另一瓶放入恒温培养箱中，在（20±1）℃培养5d后，测其溶解氧。溶解氧的测定可用碘量法和氧电极法。
（2）需经稀释水样的测定 若水样中的有机物较多、BOD5大于6mg/L时应稀释。水样中有足够的微生物，采用稀释法测定，无足够微生物，采用稀释与接种法。
①稀释倍数的确定：稀释倍数可根据水样的TOC、高锰酸盐指数（IMn）或COD的测定值由表5-2列出的BOD5与上述参数的比值R估计样品BOD5的期望值，再根据表5-3确定稀释倍数，一个样品做2～3个不同的稀释倍数。
表5-2 典型的比值（R）
表5-3 测定BOD5的稀释倍数
续表
由表5-2选择适当的R值，按下式计算BOD5的期望值：
式中 ρ——BOD5的期望值，mg/L(www.xing528.com)
Y——TOC、高锰酸盐指数或COD，mg/L
由估算出的BOD5的期望值，按表5-3确定稀释倍数。
②样品稀释：按照选定的稀释倍数，用虹吸管沿筒壁先引入部分稀释水（或接种稀释水）于1000mL量筒中，加入需要体积的均匀水样，再引入稀释水（或接种稀释水）至刻度，轻轻混匀避免残留气泡。若稀释倍数超过100倍，可进行两步或多步稀释。
分析结果精度要求高或样品中存在微生物毒性物质时，应配制几个不同的稀释倍数，选与稀释倍数无关的结果取平均值。
③测定：按不经稀释水样的测定步骤，进行装瓶，测定当天溶解氧和培养5d后的溶解氧。
④空白样品：另取两个溶解氧瓶，用虹吸法装满稀释水（或接种稀释水）作为空白，分别测定5d前后的溶解氧含量。
在BOD5测定中，一般采用叠氮化钠修正法测定溶解氧。如遇干扰物质，应根据具体情况采用其他测定法。溶解氧的测定方法后附。
（3）BOD5计算
①不经稀释水样：
式中 ρ1——水样在培养前的溶解氧质量浓度，mg/L
ρ2——水样经5d培养后，剩余溶解氧质量浓度，mg/L
②经稀释水样：以表格形式列出稀释水样（或接种稀释水样）和空白样品在培养前后实测溶解氧的质量浓度，然后按下式计算水样BOD5：
式中 ρ1——稀释水样（或接种稀释水样）在培养前的溶解氧质量浓度，mg/L
ρ2——稀释水样（或接种稀释水样）经5d培养后，剩余溶解氧质量浓度，mg/L
ρ3——空白样品在培养前的溶解氧质量浓度，mg/L
ρ4——空白样品在培养后的溶解氧质量浓度，mg/L
f1——稀释水（或接种稀释水）在培养液中所占比例
f2——水样在培养液中所占比例
（五）注意事项
（1）水中有机物的生物氧化过程分为碳化阶段和硝化阶段，测定一般水样的BOD5时，硝化阶段不明显或根本不发生，但对于生物处理的出水，因其中含有大量硝化细菌，因此，在测定BOD5时也包括了部分含氮化合物的需氧量。对于这种水样，如只需测定有机物的需氧量，应加入丙烯基硫脲硝化抑制剂。
（2）在两个或三个稀释倍数的样品中，凡消耗溶解氧大于2mg/L和剩余溶解氧大于2mg/L都有效，计算结果时应取平均值。结果小于100mg/L，保留一位小数；结果为100～1000mg/L，取整数；结果大于1000mg/L，以科学计数法表示。结果还应注明样品是否经过过滤、冷冻或均质化处理。
（3）为检查稀释水和接种液的质量，以及实验人员的操作技术，可将20mL葡萄糖—谷氨酸标准溶液用接种稀释水稀释至1000mL，测其BOD5，其结果应为180～230mg/L。否则，应检查接种液、稀释水或操作是否存在问题。
（六）思考与讨论
（1）当样品中含有大量硝化细菌时，为什么要加入丙烯基硫脲硝化抑制剂？
（2）根据实际实验条件和操作情况，分析影响测定准确度的因素。
（七）碘量法测定溶解氧
1.方法
采用叠氮化钠修正法。
2.仪器
（1）溶解氧瓶 250～300mL。
（2）酸式滴定管。
（3）锥形瓶。
（4）移液管。
3.试剂
（1）硫酸锰溶液 称取480g四水合硫酸锰（MnSO4·4H2O）溶于水，用水稀释至1000mL。此溶液加至酸化过的碘化钾溶液中，遇淀粉不得产生蓝色。
（2）碱性碘化钾—叠氮化钠溶液 称取500g氢氧化钠，溶解于300～400mL水中；称取150g碘化钾，溶于200mL水中；称取10g叠氮化钠，溶于40mL水中。待氢氧化钠冷却后，将上述三种溶液混合，加水稀释至1000mL，贮于棕色瓶中，用橡胶塞塞紧，避光保存。
（3）硫酸（标定硫代硫酸钠溶液用）1+5。
（4）10g/L淀粉溶液 称取1g可溶性淀粉，用少量水调成糊状，再用刚煮沸的水稀释至100mL。冷却后，加入0.1g水杨酸或0.4g氯化锌防腐。
（5）0.0250mol/L重铬酸钾（1/6K2Cr2O7）标准溶液 称取于105～110℃烘干2h并冷却的重铬酸钾（优级纯）1.2258g，溶于水，移入1000mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀。
（6）硫代硫酸钠标准溶液 称取6.2g五水合硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H2O）溶于煮沸放冷的水中，加0.2g碳酸钠，用水稀释至1000mL，贮于棕色瓶中。使用前用0.0250mol/L重铬酸钾标准溶液标定。
（7）400g/L氟化钾溶液 称取40g二水合氟化钾（KF·2H2O）溶于水中，用水稀释至100mL，贮于聚乙烯瓶中备用。
4.测定步骤
（1）溶解氧的固定 用吸量管插入溶解氧瓶的液面下加入1mL硫酸锰溶液、2mL碱性碘化钾—叠氮化钠溶液，盖好瓶塞，颠倒混合数次，静置。一般在取样现场固定。如水样含Fe3+在100mg/L以上时干扰测定，需在水样采集后，先用吸量管插入液面下加入1mL400g/L氟化钾溶液。
（2）打开瓶塞，立即用吸量管插入液面下加入2.0mL硫酸。盖好瓶塞，颠倒混合摇匀，至沉淀全部溶解，放于暗处静置5min。
（3）吸取100.00mL上述溶液于250mL锥形瓶中，用硫代硫酸钠标准溶液滴定至溶液呈淡黄色，加入1mL淀粉溶液，继续滴定至蓝色刚好褪去，记录硫代硫酸钠标准溶液用量。用下式计算水样中溶解氧的质量浓度：
式中 c——硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L
V——滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL
8——氧（1/4O2）的摩尔质量，g/mol
10000——滴定时取水样溶液的体积，mL
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
