水中大肠菌群数的测定实验成果

（一）实验目的

（1）了解和学习水中大肠菌群的测定原理和测定意义。

（2）学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。

（二）实验原理

所谓大肠菌群是指在37℃、24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成。

水的大肠菌群数是指100mL检测水样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数（MPN）表示。由于大肠菌群在肠道内数量最多，所以，水源中大肠菌群的数量是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。我国饮用水标准规定：大肠菌群数每升中不超过3个。

（三）实验器材

（1）锥形瓶、试管、移液管（1mL、10mL）、培养皿、接种环、试管架、酒精灯。

（2）蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠、溴甲酚紫乙醇溶液、蒸馏水。

（3）10%NaOH、10%HCl、精密pH试纸6.4～8.4。

（四）实验前准备工作

1.制作培养基

（1）乳糖蛋白胨培养基（供多管发酵法的复发酵用）

配方：蛋白胨10g、牛肉膏3g、乳糖5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL、蒸馏水1000mL、pH=7.2～7.4。

制备：按配方分别称取各药品溶解于1000mL蒸馏水中，调整pH为7.2～7.4。加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀后，分装于试管内，每管10mL，另取一小倒管倒放入试管内。塞好棉塞、包扎好。置于高压灭菌锅内，0.07MPa、115℃灭菌20min，取出置于阴冷处备用。

（2）三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（供多管法初发酵用）按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制，分装于试管中，每管5mL。再分装大试管，每管装50mL，然后在每管内放置小倒管。塞棉纱、包扎，置高压灭菌锅内以0.07MPa灭菌20min，取出置于阴冷处备用。

2.水样的采集、保存和处置

可用自来水或受粪便污染的湖、河水。

（五）实验步骤

多管发酵法适用于饮用水、水源水，特别是浑浊度高的水中的大肠菌群测定。

1.生活饮用水的测定步骤

（1）初步发酵实验 在2支各装有50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大发酵管中，以无菌操作各加入100mL水样；在10支各装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的发酵管中，以无菌操作各加入10mL水样，混匀后置于37℃恒温箱中培养24h，观察其产酸产气的情况。

情况分析：

①若培养基红色不变为黄色，小导管没有气体，即不产酸不产气，为阴性反应，表明无大肠菌群存在。

②若培养基由红色变为黄色，小导管有气体产生，即产酸又产气，为阳性反应，说明有大肠菌群存在。

③培养基由红色变为黄色说明产酸，但不产气，仍为阳性反应，表明有大肠菌群存在。

④若小导管有气体，培养基红色不变，也不浑浊，是操作技术上有问题，应重做检验。

以上结果为阳性者，说明水可能被粪便污染，需进一步检验。

（2）确定性实验 用平板划线分离，将经培养24h后产酸（培养基呈黄色）、产气或只产酸不产气的发酵管取出，以无菌操作，用接种环挑取一环发酵液于品红亚硫酸钠培养基（或伊红美蓝培养基）平板上划线分离，共三个平板。倒置于37℃恒温箱内培养18～24h，观察菌落特征。如果平板上长有如下特征的菌落并经涂片和进行革兰染色，结果为革兰阴性的无芽孢杆菌，则表明有大肠菌群存在。

在品红亚硫酸钠培养基平板上的菌落特征：(www.xing528.com)

①紫红色，具有金属光泽的菌落；

②深红色，不带或略带金属光泽的菌落；

③淡红色，中心色较深的菌落。

在伊红美蓝培养基平板上的菌落特征：

①深紫黑色，具有金属光泽的菌落；

②紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；

③淡紫红色，中心色较深的菌落。

（3）复发酵实验 用无菌接种环在具有上述菌落特征、革兰染色阴性的无芽孢杆菌的菌落上挑取一环于装有10mL普通浓度乳糖蛋白胨培养基的发酵管内，每管可接种同一平板上（即同一初发酵管）的1～3个典型菌落的细菌。盖上棉塞置于37℃恒温箱内培养24h，有产酸、产气则证实有大肠菌群存在。

根据证实有大肠菌群存在的阳性菌（瓶）数，查表1-5至表1-8，报告每升水样中大肠菌群数。

根据阳性管数及实验所用的水样量，运用数理统计原理计算出每升（或每100mL）水样中总大肠菌群的最大可能数目（MPN），可用下式计算：

式中 A——阳性管数

B——阴性管数水样体积，mL

T——全部水样体积，mL

MPN的数据并非水中实际大肠菌群的绝对浓度，而是浓度的统计值。为了使用方便，现已制成检索表。所以根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数可直接检索表1-5至表1-8，即得结果。

2.水源水中大肠菌群的测定步骤

（1）稀释水样 根据水源水的清洁程度确定水样的稀释倍数，除严重污染外，一般稀释倍数为10^-1及10^-2，稀释方法见实验五所述的10倍稀释法，均需无菌操作。

（2）初步发酵实验 在无菌条件下，用无菌移液管吸取1mL10^-2和10^-1的稀释水样及1mL原水样，分别注入装有10mL普通浓度乳糖蛋白胨培养基的5个发酵管中，另取10mL原水样注入装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的发酵管中，如果为较清洁的水样，可再取100mL水样注入装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的发酵瓶中，置37℃恒温箱中培养24h后观察结果。以后的测定步骤与生活饮用水的测定方法相同。

根据证实有大肠菌群存在的阳性管数或瓶数查表1-10至表1-13，即可求得每100mL水样中存在的大肠菌群数，乘以10即为1L水中的大肠菌群数。

表1-10 大肠菌群检验表 单位：个/L

注：水样总量300mL（二份100mL，十份10mL）。此表用于检测生活饮用水。

表1-11 大肠菌群检验表（-1） 单位：个/L

注：水样总量111.1mL。+表示有大肠菌群，—表示无大肠菌群。

表1-12 大肠菌群检验表（-2） 单位：个/L

注：水样总量11.1mL。+表示有大肠菌群，—表示无大肠菌群。

表1-13 大肠菌群的最可能数 单位：个/100mL

（六）实验作业

将实验结果记录在表1-14中，并对所测样品进行评价。

表1-14 监测分析原始记录（生物）