在不同的生态系统中，生存着不同的微生物；在同一生态系统中，不同种类的微生物混在一起生活。如果要获得某种微生物时，就需要从混杂的微生物类群中将其分离出来，得到只含有该种微生物的纯培养。这种方法就称为微生物的分离与纯化。
微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本技能，其中无菌操作是微生物接种技术的关键。由于实验目的、实验器皿、培养基种类等不同，所用的接种方法也不尽相同。不同的接种方法，所使用的接种工具也不同。
（一）实验目的
（1）从环境中分离、培养微生物，掌握一些常用的分离和纯化微生物的方法。
（2）学会几种接种技术。
（二）仪器和器材
（2）已灭菌的培养基、待测样品（土壤、水体、活性污泥等）。
（三）纯种分离的操作方法及步骤
1.稀释平板法
（1）取样 用无菌瓶到现场取一定的土壤或湖水或待测水样，迅速带回实验室。
（2）稀释水样
①将5只装有9mL无菌水的试管10-1、10-2、10-3、10-4、10-5依次编号。
②以无菌操作，用1mL的无菌吸管吸取1mL的待测水样置于第一个无菌水试管中，将吸管吹吸三次，摇匀，即为10-1浓度的混合菌液；用1mL的无菌吸管吸取1mL10-1浓度的菌液置于第二个无菌水试管中，将吸管吹吸三次，摇匀，即为10-2浓度的混合菌液。依次类推稀释到10-5。
（3）平板制作
①将无菌培养皿编号10-3、10-4、10-5各三套，另取一套为对照。
②另取一支1mL的无菌吸管从浓度小的10-5菌液开始，依次分别取1mL菌液于相应编号的培养皿内，每个浓度做三个平板，每次吸取菌液时注意摇匀，且在吸管中反复吹吸几次。
③将已经熔化并冷却到45℃左右的培养基15～20mL注入培养皿中。倒平板方法如图1-11所示。
图1-11 倒平板方法
④将培养基注入对照培养皿冷凝后，倒置于37℃恒温培养箱内培养24～48h，然后观察结果。
2.平板划线法
（1）取样，同前。
（2）将熔化并冷却到50℃左右的培养基15～20mL倒入培养皿中，制成平板。
（3）以无菌操作，右手持灼烧灭菌冷却的接种环取一环活性污泥（或土壤悬液、污水等其他样品），左手拿培养皿，方法同前打开皿盖，将接种环在培养皿表面轻轻地划线，可以是平行划线、扇形划线，或其他连续划线。划线后，盖好皿盖，培养皿倒置于37℃恒温培养箱内培养24～48h，然后观察结果。接种环用过之后，随即灼烧灭菌。
3.平板表面涂布法
（1）取样，同前。
（2）稀释样品，同前。
（3）制作平板，同前。
（4）在无菌的环境中，用无菌移液管吸取一定量的经过稀释的样品于平板上，用三角刮板在平板上旋转涂布均匀。
（5）正置，放在恒温培养箱中培养，次日把培养皿倒置继续培养。
（6）待长出菌落，分析观察结果。
采用以上任一方法分离后，若仍然有杂菌存在，可用相同分离方法再次分离，直至达到纯化标准为止。
（四）接种技术
1.接种用具
常用的接种用具有接种针、接种环、接种铲、移液管、滴管、三角刮刀、刮刀和定量移液器等。前三种用具主要用于从固体培养基到固体培养基或固体培养基到液体培养基的接种，后几种用具多用于从液体培养基到液体培养基或液体培养基到固体培养基的接种。接种用具如图1-12所示。
图1-12 接种用具
2.接种环境(www.xing528.com)
微生物的分离培养、接种等操作，需要在无菌操作室、无菌操作箱或生物超净工作台等无菌环境下进行。
3.接种技术
接种是将一定量的微生物在无菌的条件下从一种培养基中转移到另一无菌的并适合该菌生长繁殖所需的培养基中的过程。
（1）斜面接种 从已生长好菌种的斜面培养基上，挑取少量菌种，移植到另一新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下：
①准备工作：接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人、组别等。
②点燃酒精灯。
③接种：操作必须按无菌操作方法进行，具体操作流程（图1-13）如下：
图1-13 接种技术
手持试管：将菌种和待接斜面的两支试管放在左手上，用拇指压住两支试管，中指位于两支试管中间，斜面向上，管口齐平，使它们位于水平位置。
旋松管塞：用右手旋松管塞，以便接种时易拔出管塞。
灼烧接种环：右手拿接种环，在酒精灯上，灼烧接种环及可能伸入到试管内的部分，重复此操作。
拔管塞：用右手的无名指、小拇指和手掌边取下菌种和待测试管的管塞，然后将试管口缓慢地过火灭菌。
接种环冷却：将灼烧过的接种环伸入菌种管内，触及没有长菌的培养基部分，使接种环冷却。
取菌：接种环冷却后，轻轻蘸取少量菌体或孢子，然后将接种环移出菌种管。不要让接种环的部分碰到管壁。
接种：在火焰旁迅速将蘸有菌种的接种环伸入到另一待接试管中，从斜面培养基的底部向上做“z”形来回密集划线（图1-14）。
塞管塞：取出接种环，灼烧试管口，在火焰旁将管塞塞上。
灭菌：将接种环灼烧灭菌。
图1-14 斜面接种
（2）液体接种
①从斜面培养基到液体培养基的接种方法：当接种量少时，取菌种，将蘸有菌种的接种环送入液体培养基中，使菌环上的菌种洗入液体培养基内并轻轻旋转，使菌环上的菌全部进入到液体培养液中。取出接种环并灼烧，试管过火后塞上棉塞，将培养液体轻轻摇动，使菌体在培养基内分布均匀，放置在恒温培养箱中培养，等待结果。
当接种量大时，可先在斜面培养基试管中加入定量无菌水，用接种环把菌苔刮下并散开，试管口在酒精灯上过火灭菌，再把菌悬液倒入液体培养基中。
②从液体培养基到液体培养基的接种方法：用液体培养物接种液体培养基时，在火焰旁用无菌的吸管或移液管吸取一定量的菌液接种，摇匀，放置培养箱中培养。
（3）固体接种 固体接种最普遍的形式是接种固体菌制剂。
①斜面培养基接种到固体培养基：在斜面培养基的试管中加入定量无菌水，把菌苔刮洗下来，制成菌悬液，按无菌操作方法将菌悬液直接倒入固体培养基中搅拌均匀，即可培养。
②用固体种子菌接种到固体培养基中：直接把接种的材料包括用孢子粉、菌丝孢子混合菌或其他固体培养的种子菌，混入灭菌的固体培养基中，充分搅拌，混合均匀后，进行培养。
（4）穿刺接种 这是一种用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体，之后把它穿刺在固体或半固体培养基上的一种接种方法。具体操作如下：
①在酒精灯火焰旁，左手持试管，右手旋松棉塞。
②右手拿接种针灼烧灭菌，拔出棉塞。
③接种针先在培养基无菌处冷却，再用接种针的针尖蘸取少量菌种。
④将接种针自培养基中心垂直地刺入培养基中，且将接种针刺到试管的底部。
⑤沿接种线拔出接种针，塞上棉塞，灼烧接种针灭菌。
⑥接种过的试管直立在试管架上，然后培养。
⑦如果有运动能力的细菌，从接种线向外运动，所形成的接种线较粗，反之则细。
（五）思考题
（1）为什么接种环灼烧后要在无菌的培养基上蘸一蘸？
（2）如何检查细菌是否能够真正地运动？
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