（一）实验目的
（1）熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。
（2）掌握培养基的制备方法。
（3）学会灭菌技术。
（二）仪器和器材
（3）精密pH试纸6.4～8.4、10%HCl、10%NaOH。
（5）高压蒸汽灭菌锅、电子天平、烘箱、电磁炉、小煮锅、冰箱等。
（三）实验内容
1.培养基的制备
配制培养基的流程：原料称量、溶解→调节pH→分装→过滤→塞棉塞和包装→灭菌→贮存。
（1）原料称量、溶解 根据培养基配方，准确称取各种原料成分，然后依次将各种原料加入水中，用玻璃棒搅拌使之溶解。配制固体培养基时，预先将琼脂称好洗净（粉状琼脂可直接加入，条状琼脂用剪刀剪成小段，以便熔化），然后将液体培养基煮沸，再把琼脂放入，继续加热至琼脂完全熔化。
（2）调节pH 液体培养基配好后，一般要调节至所需的pH。常用盐酸及氢氧化钠溶液进行调节。调节培养基酸碱度最简单的方法是用精密pH试纸进行测定。
（3）分装 培养基配好后，要根据不同的使用目的，分装到各种不同的容器中。不同用途的培养基，其分装量应视具体情况而定，要做到适量、实用。培养基是多种营养物质的混合液，大多具有黏性，在分装过程中，应注意不使培养基沾污管口和瓶口，以免污染棉塞，造成杂菌生长。分装培养基，通常使用大漏斗（小容量分装）或医用灌肠器（大容量分装）。培养基的分装量，应依照使用目的及实验的具体情况决定。
（4）过滤 用纱布、滤纸或棉花过滤均可。如果培养基杂质很少或实验要求不高，可不过滤。
（5）塞棉塞和包装 培养基分装到各种规格的容器后，应按管口或瓶口的不同大小分别塞以大小适度、松紧适合的棉塞（图1-7）。由于棉塞外面容易附着灰尘及杂菌，且灭菌时容易凝结水气，因此，在灭菌前和存放过程中，应用牛皮纸或旧报纸将管口、瓶口或试管包起来。
图1-7 包扎方法
（6）灭菌 培养基制备完毕后应立即进行高压蒸汽灭菌。如延误时间，会因杂菌繁殖生长，导致培养基变质而不能使用。
（7）贮存 培养基较长时间搁置不用或存贮不当，往往会因污染、脱水或光照等因素而变质，所以培养基一次不宜配制过多，最好是现配现用。因工作需要或一时用不掉的培养基应放在低温、干燥、避光而洁净的地方保存。对含有染料或其他对光敏感的培养基，要特别注意避光保存，特别是避免阳光长时间直接照射。
2.灭菌和消毒
采用强烈的理化因素使除任何物体外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称为灭菌。消毒则是用较温和的物理或化学方法杀死物体上绝大多数微生物（主要是病原微生物和有害微生物的营养细胞），实际上是部分灭菌。
微生物学实验最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌效果。高温的致死作用，主要是使微生物的蛋白质和核酸等重要生物大分子发生变性。此外，过滤除菌、射线灭菌和消毒、化学药物灭菌和消毒等也是微生物学操作中不可缺少的常用方法。
（1）干热灭菌
①火焰灭菌：这种方法灭菌迅速彻底，微生物接种工具如接种环、接种针或其他金属用具等，可直接在酒精灯火焰上灼烧进行灭菌。此外，接种过程中，试管或三角瓶口等，也可以通过火焰灼烧灭菌。
②加热灭菌：用干燥热空气杀死微生物的方法称为加热灭菌。将灭菌物品置于干燥箱内，在160～170℃加热1～2h。灭菌时间可根据灭菌物品性质与体积做适当调整，以达到灭菌目的。玻璃制品、金属用品及能耐高温的物品都可以用此法灭菌。但是，培养基、橡胶制品、塑料制品等不能使用加热灭菌。加热灭菌箱如图1-8所示。
图1-8 加热灭菌箱
1—温度计与排气孔 2—温度调节旋钮 3—指示灯 4—温度调节器 5—鼓风钮
a.加热灭菌操作步骤
装箱：将准备灭菌的玻璃器材洗涤干净、晾干，包装好放入灭菌箱内，关好箱门。
灭菌：接通电源，打开灭菌箱排气孔，待温度升至80～100℃时，关闭排气孔。继续升温至160～170℃时，开始计时，恒温1～2h。
灭菌结束后，断开电源，自然降温至60℃，打开加热灭菌箱门，取出物品放置备用。
b.注意事项：灭菌的玻璃器皿切不可有水，以防止炸裂。灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响温度均匀上升。灭菌物品不能直接放在烘箱底板上，以防止包装纸或棉花被烤焦。灭菌温度恒定在160～170℃为宜，温度超过180℃，棉花、报纸会烧焦甚至燃烧。降温时，需待温度自然降至60℃以下才能打开箱门取出物品，以免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
（2）湿热灭菌 湿热灭菌是利用热蒸汽灭菌。湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。原因：热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强，水分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作用弱键，更易使蛋白质变性；热蒸汽比热空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物；蒸汽存在潜热，当气体转变为液体时，可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体的温度。
多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理15min后即可杀死，酵母菌和真菌的孢子要耐热些，要用80℃以上的温度才能杀死，而细菌的芽孢更耐热，一般要在120℃下处理15min才能杀死。湿热灭菌常用的方法有常压蒸汽灭菌和高压蒸汽灭菌。
①常压蒸汽灭菌：常压蒸汽灭菌是湿热灭菌的方法之一，在不能密闭的容器里产生蒸汽进行灭菌。由于常压蒸汽的温度不超过100℃，压力为常压，大多数微生物的营养细胞能被杀死，但芽孢细菌却不能在短时间内死亡，因此必须采用间歇灭菌或持续灭菌的方法来杀死芽孢细菌，达到完全灭菌。
巴氏消毒法：是一种低温消毒法，用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法。具体方法可分为两类，第一类是低温维持法，如在63℃下保持30min可进行牛奶消毒；另一类是高温快速法，用于牛奶消毒时只要在85℃下保持5min即可。但是巴氏消毒法不能杀灭引起Q热的病原体。
间歇灭菌法：适用于不耐热培养基的灭菌。方法：将待灭菌的培养基在100℃下蒸煮30～60min，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或20～30℃下保温过夜，诱导残留的芽孢萌发，第二天再以同样的方法进行灭菌，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。
蒸汽持续灭菌法：微生物制品的土法生产或食用菌菌种制备时常用这种方法。在容量较大的蒸锅中进行。从蒸汽大量产生开始，继续加大火力保持充足蒸汽，待锅内温度达到100℃时，持续加热3～6h，杀死绝大多数芽孢和全部营养体，达到灭菌目的。
②高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌法是微生物学研究和教学中应用最广、效果最好的湿热灭菌方法。(www.xing528.com)
灭菌原理：将待灭菌的物体放在有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭。再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100℃以上。为达到良好的灭菌效果，一般要求温度应达到121℃（压力为0.1MPa）维持35min。此法适用于一切微生物学实验室、医疗保健机构中对培养基及多种器材、物品的灭菌。在空气完全排除的情况下，一般培养基只需在0.1MPa下灭菌30min即可。
灭菌设备：主要设备是高压蒸汽灭菌锅，有立式、卧式及手提式等不同类型。高压蒸汽灭菌锅如图1-9所示。
图1-9 高压蒸汽灭菌锅
手提式灭菌锅使用方法：
a.加水：直接加水至标定水位线以上。
b.装锅：将待灭菌的物品装入锅内，不要太紧太满。关严锅盖，打开排气阀。
c.加热排气：合上电闸通电加热。持续加热至锅内的水沸腾并有大量蒸汽自排气阀冒出时，维持2～3min以排除冷空气。
d.保温保压：当压力升至0.1MPa时，温度达121℃，此时应控制热源。保持压力，维持30min后，切断热源。
e.出锅：当压力表降至“0”处，稍停，使温度继续降至100℃以下后，打开排气阀，旋开固定螺旋，开盖，取出灭菌物。注意切记在锅内压力尚在“0”点以上，温度也在100℃以上时开启排气阀，否则会因压力骤然降低，而造成培养基剧烈沸腾冲出管口或瓶口，污染棉塞，以防培养时杂菌污染。
f.保养：灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出，以保持内壁及内胆干燥，盖好锅盖。
（3）紫外线杀菌 紫外线的波长范围是15～300nm，其中波长在260nm左右的紫外线杀菌作用最强。紫外灯是人工制造的低压水银灯，能辐射出波长主要为253.7nm的紫外线，杀菌能力强且较稳定。紫外线杀菌作用是因为它可以被蛋白质（波长为280nm）和核酸（波长为260nm）吸收，造成这些分子的变性失活。紫外光穿透能力很差，不能穿过玻璃、衣服、纸张或大多数其他物体，但能够穿透空气，因而可以用作物体表面或室内空气的杀菌处理，在微生物学研究及生产实践中应用较广。在一般实验室、接种室、接种箱中，均可利用其杀菌。紫外灯的功率越大，效能越高。但是紫外线对眼黏膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，所以应避免在紫外灯下工作，必要时需穿防护工作衣帽，并戴有色眼镜进行工作。
3.常用玻璃器皿的清洁与灭菌
（1）清洁 清洁的玻璃器皿是得到正确实验结果的重要条件之一。要求所使用的器皿不能妨碍得到正确的结果，至少必须洗去灰尘、油垢、无机盐类等物质。器皿洗涤之后，必须晾干或烘干备用。
①洗涤工作注意事项
a.任何洗涤法，都不应对玻璃器皿有所损伤。所以不能使用对玻璃器皿有腐蚀作用的化学试剂，也不能使用比玻璃硬度大的制品来擦拭玻璃制品。
b.用过的器皿必须及时洗涤，放置太久会增加洗涤的困难。随时洗涤还可以提高器皿的使用率。
c.含有对人有传染性的或者是属于植物免疫的微生物试管、培养皿及其他容器，应先浸在5%石炭酸溶液内或蒸煮灭菌后再进行洗涤。
d.盛过有毒物品的器皿，不要与其他器皿放在一起。
e.难洗涤的器皿不要与易洗涤的器皿放在一起，以免增加洗涤的麻烦。
f.强酸强碱及其他氧化物和有挥发性的有毒物品，都不能倒在洗涤槽内，必须倒在废水缸中。
g.剩余汞溶液，切勿装在铝锅等金属器皿中，以免引起金属的腐蚀。
②洗涤剂的种类及应用
水：水是最主要的洗涤剂，但只能洗去可溶解在水中的沾污物。不溶解于水的沾污物，如油、蜡等，必须用其他方法处理以后，再用水洗。
肥皂：肥皂是很好的去污剂。一般肥皂的碱性都不强，不会损伤器皿和皮肤，所以洗涤时常用肥皂。热的肥皂水（5%）去污力很强，洗去器皿上的油脂很有效。
去污粉：去污粉内含有碳酸钙、碳酸镁等，有起泡沫和除油污的作用，有时也可以加一些盐、硼砂等，以增加摩擦作用。一般玻璃器皿、搪瓷器皿等都可以使用去污粉。
洗衣粉：洗衣粉有很强的去污能力。用1%的洗衣粉液洗涤载玻片和盖玻片，能达到良好的清洁效果。
洗涤液：通常用的洗涤液是重铬酸钾的硫酸溶液，是一种强氧化剂，去污能力很强，常用它洗涤玻璃和瓷质器皿上的有机质。
硫酸及碱：器皿上如有煤膏、焦油以及树脂一类物质，可以用浓硫酸或40%氢氧化钠溶液洗。
有机溶剂：有时洗涤油脂物质及其他不溶于水也不溶于酸和碱的物质，需要用特定的有机溶剂，常用的有机溶剂有汽油、丙酮、酒精、苯、二甲苯及松节油等。
③各种玻璃器皿的洗涤方法
新玻璃器皿的洗涤法：新购置的玻璃器皿含有游离碱，应用2%的盐酸溶液浸泡数小时，再用水充分冲洗干净。
含有琼脂培养基的玻璃器皿的洗涤法：先用小刀或铁丝将器皿中的琼脂培养基刮下，并用刷子蘸肥皂擦洗内壁，然后用自来水洗去肥皂。
载玻片及盖玻片的洗涤法：新载玻片可放入1%的洗衣粉液内煮沸1min，待沸点泡平下后，再煮沸1min，如此2～3次，待冷却后用自来水冲洗干净。用过的载玻片和盖玻片，应用纸擦去油垢，然后浸入洗衣粉液中，方法同新载玻片洗衣粉液洗涤法，只不过时间要长些（30min左右）。
（2）灭菌
①包装：移液管的吸端用细铁丝将少许棉花塞入构成1～1.5cm长的棉塞。棉塞要塞得松紧适宜。将塞好棉花的移液管的尖端，放在4～5cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成30°夹角，使包装纸包住移液管的尖端，压紧移液管，在桌面上向前搓转，使纸条螺旋式地包在移液管外面，余下纸头折叠打结。吸管包裹法如图1-10所示。
图1-10 吸管包裹法
按实验需要，可单支或多支包装，待灭菌。
②用棉塞将试管管口和锥形瓶瓶口部塞住。
③培养皿由一底一盖组成一套，用牛皮纸或报纸将10套培养皿（皿底朝里，皿盖朝外，5套、5套相对）包好。
④按照实验要求进行灭菌。
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