微生物的染色及革兰染色法：实验目的、步骤和结果

（一）实验目的

学习微生物的染色原理、染色的基本操作步骤、无菌操作技术，学习细菌的单染色和革兰染色法。

（二）实验原理

用于生物染色的染料主要有碱性、酸性和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸时培养基pH下降，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。

1.单染色法

单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。如果仅为了在显微镜下看清细菌的形态，用单染色即可。但此方法难于辨别细菌细胞的构造。

2.复染色法

用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌。主要的复染色法有革兰染色法和抗酸性染色法。抗酸性染色法多在医学上采用。

革兰染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰法可将所有的细菌区分为革兰阳性菌（G⁺）和革兰阴性菌（G^-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法能将细菌分为G⁺菌和G^-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G^-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G⁺菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

（三）仪器和器材

（1）显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯。

（2）石炭酸复红染色液、草酸铵结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、番红（沙黄）复染液。

（3）枯草杆菌、大肠杆菌。

（四）实验方法

1.细菌的简单染色步骤

（1）涂片 取干净载玻片一块，在正面边角做个记号，并滴一滴无菌蒸馏水于载玻片的中央，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。无菌操作步骤如图1-5所示。

图1-5 无菌操作步骤

（2）干燥 让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方用温火烘干。注意不要在高温下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。

（3）固定 手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2～3次固定（以不烫手为宜）。

（4）染色 在载玻片上滴加染色液（石炭酸复红染色液或草酸铵结晶紫染色液任选一种），使染液在涂有细菌的部位作用约1min。

（5）水洗 倾去染液，斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至水呈无色为止。

（6）干燥 将载玻片倾斜，用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，注意勿将细菌擦掉。

（7）镜检 用显微镜观察，并用铅笔绘出细菌形态图。(www.xing528.com)

2.细菌的革兰染色步骤

先用草酸铵结晶紫染色，经碘—碘化钾（媒染剂）处理后用乙醇脱色，最后用番红液复染。如果细菌能保持草酸铵结晶紫与碘的复合物而不被乙醇脱色，用番红液复染后仍呈紫色者为革兰阳性菌。被乙醇脱色，用番红液复染后呈红色者为革兰阴性菌。

（1）涂片 方法与单染色涂片相同。

（2）晾干 与单染色法相同。

（3）固定 与单染色法相同。

（4）结晶紫染色 用结晶紫染液染1min，水洗。

（5）媒染 加碘液媒染1min，水洗。

（6）脱色 将载玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20～25s至流出液无色，立即水洗。注意为了节约乙醇，可将乙醇滴在涂片上静置30～45s，水洗。

（7）复染 用番红染液复染1～5min，水洗。染色结果如图1-6所示。

（8）干燥 与单染色法相同。

（9）镜检 用显微镜观察。先用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明革兰染色的结果。

图1-6 染色结果

（五）实验完毕后的处理

（1）将浸过油的镜头按正确方法擦拭干净。先用擦镜纸将油镜上的油擦去，再用擦镜纸蘸少许二甲苯将镜头擦2～3次，最后用干净的擦镜纸将镜头擦2～3次。注意擦镜时向一个方向擦拭。

（2）使用后的染色载玻片用废纸将香柏油擦干净。

（六）注意事项

（1）革兰染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰阴性菌也会被染成革兰阳性菌。

（2）染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去载玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。

（七）思考题

（1）细菌涂片为什么不能过厚？

（2）通过革兰染色，你认为它在微生物学中有何实践意义？