血球计数板的构造与使用方法

（一）实验目的

（1）掌握细菌的直接计数法技术。

（2）学会几种细菌直接计数法的应用。

（二）实验原理

细菌直接计数法包括计数板法、涂片染色法、比例计数法等，计数板法最为常用。该法是根据测定对象选用特制的载玻片（即计数板），其上刻有已知面积的大小方格（即计数格），当盖上盖玻片后，盖玻片与计数格间的高度为已知，因此计数格的容积为一定。根据在显微镜下测得的该计数格中的微生物个数，可换算出单位体积待测液中所含微生物数。

（三）实验仪器

显微镜、血球计数板、吸管、盖玻片等。

（四）实验试剂

香柏油、酒精、待测菌液。

（五）实验操作

1.血球计数板的构造

血球计数板是一种专门用于计数较大单细胞微生物的一种仪器，由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的，玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面刻有一个方格网。方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室。这一大方格的长和宽各为1mm，深度为0.1mm，其容积为0.1mm³，即1mm×1mm×0.1mm方格的计数板，其平面及纵切面图如图1-4（a）（b）所示。图1-4（c）为放大后的计数格，在显微镜下，可见众多的大小方格与长格，一般是以小方格为基础进行测数，每一小方格面积为1/400mm²（见计数板上的标注）。(www.xing528.com)

图1-4 血球计数板示意图

2.操作步骤

（1）稀释 将样品稀释到合适的浓度，一般将样品稀释到每一中方格中有15～20个细胞为宜。

（2）加样 取已洗净的血球计数板，将盖玻片盖住中央计数室，用无菌吸管吸取经充分摇匀并打散开的待测菌液，小心地滴一小滴于盖玻片边缘（勿过多），菌液自行渗入并布满计数格处，注意勿产生气泡。

（3）显微计数 加样后静置3～5min，镜检。根据受检微生物的个体大小选用适宜的接物镜头，先用低倍镜找好计数室位置，然后换用高倍镜进行计数。计数前如发现菌液过浓，可稀释一定倍数后再镜检计数，一般以每小方格内有5～10个菌体为宜。按对角线取点，至少计数20个大方格中的微生物细胞数。计数时注意转动细调节器，使液层上下菌数都可测到，每份菌液样品至少计数两次，取其平均值。

（4）结果计算 以高度为0.1mm的血细胞计数板为例：

①先求出每小方格（即1/400mm²）中的平均菌数A。

②每毫升（mL）菌液中的总菌数=A×400×1000×稀释倍数。

（5）清洗 血球计数板使用完毕后，在水管下用水冲洗，切勿用硬物洗刷，冲洗后风干即可。如镜检发现小格内有残留菌体或其他沉淀物，则需重复洗涤至干净为止。

（六）思考题

如何减少测定结果的误差？