实验四：神经干动作电位和传导速度测定

【目的与原理】 各种可兴奋细胞受刺激处于兴奋状态时，都有一个共同的、最先出现的反应——动作电位。在神经细胞外表面，已兴奋部位带“负电”，未兴奋部位带“正电”，用引导电极引导此电位差，输入生物功能实验系统，在计算机显示屏上即可观察到动作电位的波形。本实验用细胞外记录法，可引导出坐骨神经的复合动作电位。坐骨神经标本包括许多种类的神经纤维成分，其各自的兴奋阈值不同，传导速度各异，所引导的动作电位为各峰电位之总和，即复合动作电位，因而其幅值在一定范围内随刺激强度增加而增大。

神经纤维兴奋的标志是产生一个可以传导的动作电位，它依局部电流或跳跃传导的方式沿神经纤维传导。其传导速度取决于神经纤维的直径、内阻和有无髓鞘等因素，可用电生理学方法测定该复合动作电位经过的距离和时间，即可计算出神经干兴奋传导的速度。

神经纤维在一次兴奋过程中，其兴奋性可发生周期性变化，包括绝对不应期、相对不应期、超常期和低常期。通过调整条件刺激和测试刺激之间的时间间隔，来测定坐骨神经干的绝对不应期。实验要达到以下目标：

（1）掌握神经干动作电位细胞外引导记录方法及基本波形的判断和测量，学习电生理实验的基本方法和基本仪器的使用。

（2）掌握神经干动作电位传导速度及其不应期的测定方法和原理。

（3）观察神经干动作电位的波形、幅度、潜伏期，探讨其机制。

【用品】 蟾蜍（或蛙）；计算机生物信号采集、分析、处理系统；蛙手术器械1套；神经标本屏蔽盒；刺激电极；1％普鲁卡因溶液和林格液。

【操作】

1.坐骨神经-腓神经标本制备

（1）脑脊髓破坏、剪除躯干上部及内脏并剥皮：

1）破坏脑脊髓：左手握住洗净的蛙，食指压其头部前端，使头前倾（图26-3）。可见头部背面正中线上有一凹陷处，即枕骨大孔，右手持探针由此垂直刺入1～2mm，再将探针尖端向头方刺入颅腔，左右搅动，捣毁脑组织。而后退针尖至皮下，倒转针尖向下刺入椎管捣毁脊髓，至蛙四肢瘫软，抽出探针。

图26-3　破坏蟾蜍脑和脊髓

2）除去躯干上部及内脏：用粗剪刀在骶髂关节水平以上1 cm处剪断脊柱，左手捏住脊柱下方断端，注意不要损伤腹侧面两侧的坐骨神经干，使蛙头和内脏自然下垂，右手持粗剪刀沿脊柱两侧剪除一切内脏及头胸部，留下后肢、骶骨、部分脊柱及紧贴于脊柱两侧的坐骨神经。

3）剥皮：先剪去肛门周围的皮肤，然后一手捏住脊柱断端，另一只手捏住断端边缘皮肤，向下剥掉全部后肢皮肤。

（2）用粗剪刀沿脊柱正中至耻骨联合中央剪开成两半，浸于盛有林格液的烧杯中。经分离两侧肌肉，剪断沿途分支直到腘窝。坐骨神经在腘窝上方分成胫神经和腓神经，沿腓神经分离至足部，剪断。将制成的坐骨神经-腓神经标本置于林格液中浸泡数分钟，备用。

2.连接实验装置

（1）神经屏蔽盒的安装：一对刺激电极相互尽量靠近，两对记录电极尽可能分开，神经槽的所有电极都需要用小刀刮亮除去锈蚀和氧化膜并使各电极处于同一水平，以免接触不良。用镊子夹住神经标本一端的结扎线，将标本放置于电极上，方向是标本的近中端置于刺激电极上，远中端置于引导电极上。

图26-4　引导神经干动作电位的装置

（2）连接：刺激电极与计算机程控刺激器的输出端相连；距离刺激电极近的一对记录电极与计算机一通道相连，距离刺激电极远的一对记录电极与另一通道相连；两对记录电极引导的生物电信号输入计算机电位通道接口（图26-4），经程控生物放大器放大，A/D转换，计算机处理和显示。

【项目及结果观察】 开机后，双击桌面上生物功能实验系统快捷图标→进入BL-Newcentury菜单条选择实验项目（单击）→肌肉神经实验→神经干动作电位引导（单击）→进入实验观察。

（1）观察神经干双相动作电位：用单脉冲电刺激，程序参数已预先设置好，如有必要，可调节程控刺激器的波宽和幅度（波宽0.1mV，初幅度0.05 V，末幅度2～3 V），随着刺激强度逐渐加大，观察动作电位幅度与刺激强度间的关系，直至动作电位最大为止。读出阈刺激和最适刺激值。扫描时，可在屏幕上见到一个双相动作电位，即前面一个大的向上的波，后面一个向下的波（图26-5）。每次显示动作电位的同时，系统可立即计算出动作电位的幅值、波宽和潜伏期。

麻醉药对兴奋传导的阻滞作用观察：将浸有1％普鲁卡因溶液的细棉条缠于两个记录电极之间的神经干上，动作电位第二相便消失，屏幕上只呈现单相动作电位。

用高浓度氯化钾溶液滤纸片贴附神经干，观察双相动作电位的变化。

（2）神经干动作电位传导速度的测定：(www.xing528.com)

1）调节两对记录电极的位置使其尽量分开，并与神经干紧密接触。

2）调节刺激器强度以产生最大动作电位。

3）量出两记录电极之间的距离（d）。

4）测出动作电位传导所需要的时间：给神经纤维单脉冲刺激，该刺激经历时间t1后，传至距刺激电极较近的记录电极r1，引导出第一个动作电位，同样，该刺激经历时间t2后，传至距刺激电极较远的记录电极r2，引导出第二个动作电位；分别测出刺激传到引导电极r1（近）和引导电极r2（远）的时间（潜伏期t1和t2），两者之差（t2-t1）就是动作电位传导距离（d）所消耗的时间。

5）根据传导速度（v）=d/（t1-t2），测算动作电位的传导速度，单位是m/s（图26-6）。

图26-5　蟾蜍神经干双相动作电位图

图26-6　神经传导速度的测量示意图

（3）神经兴奋不应期的测定：选择双脉冲刺激，初始间隔时间为10ms，可见到与双脉冲刺激对应的两个动作电位。调节双脉冲间隔时间，从5ms开始逐渐缩小，每次减少0.1ms，随着双脉冲间隔不断缩短，两个动作电位逐渐靠近，靠近到一定程度时，第二个动作电位的幅度开始减小，直至动作电位2不出现为止。此时，第二个刺激脉冲与第一个刺激脉冲间的时间间隔即为“绝对不应期”近似值。如果第一个刺激作为条件刺激，第二个刺激则为测试刺激，当第二个动作电位消失后，加大测试刺激强度，若动作电位仍不出现，此时第二个刺激脉冲与第一个刺激脉冲间的时间间隔才是“绝对不应期”的确切值。

实验结果处理：

（1）报告双相动作电位波形图，测出其最大幅值和持续时间。

（2）根据[V=s（t2-t1）]，计算并报告神经兴奋的传导速度。

（3）报告神经兴奋的绝对不应期。

【注意事项】

（1）神经标本尽量分离长，分离干净，但不能损伤神经干。

（2）神经干的两端不要碰在屏蔽盒上，也不要把神经两端折叠在电极上，已免影响动作电位的大小。

（3）防止标本干燥，但同时注意电极间不要有过多的林格液，以免造成短路。

（4）刺激强度在开始时不要过强，先由弱强度开始，逐渐加至适宜强度，以免过强刺激伤害神经标本。

【思考题】

1.用细胞外记录法记录神经干动作电位的原理是什么？

2.神经干动作电位为什么不是“全”或“无”的？

3.改变神经干的放置方向，双相动作电位波形是否会发生变化？为什么？

4.用高浓度氯化钾溶液滤纸片贴附神经干，双相动作电位有何变化？为什么？

5.简述神经兴奋性周期变化的规律。