血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳结果 正常人体功能

【目的】 了解电泳法分离血清蛋白质的原理，加深对蛋白质两性电离与等电点性质的理解，学会醋酸纤维薄膜电泳的基本操作方法。

【原理】 血清中各种蛋白质的等电点大多在pH7以下。在pH8.6的缓冲液中，它们都带负电荷，在电场中向正极移动。因不同蛋白质等电点不同，在同一电场中所带电荷量不同，同时分子大小与分子形状也不同，因此在外加直流电场的作用下向阳极移动的速率各异，经过一定的时间电泳便可分离开来。以醋酸纤维薄膜为支持物可将血清蛋白质分离为5条色带，从正极起依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白（图26-1）。

图26-1　血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳结果

A.正常结果；B.α1球蛋白缺陷

【器材】 电泳仪、电泳槽、醋酸纤维薄膜（2 cm×8 cm）、血清加样器（可用盖玻片、X线胶片）、载玻片、镊子、恒温水浴箱、分光光度计等。

【试剂】

（1）巴比妥缓冲液（PH8.6，离子强度0.075）：巴比妥钠15.45 g，巴比妥2.76 g，蒸馏水700～800ml，加热溶解，冷后补足蒸馏水至1 000ml。

（2）氨基黑10B染色液：氨基黑10B 0.5 g，甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸馏水40ml，混合使溶解。

（3）漂洗液：甲醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，混匀，分装甲、乙、丙3瓶备用。

（4）洗脱液：0.4mol/L Na0H溶液。

（5）透明液：冰醋酸25ml，无水乙醇75ml，混匀备用。

【操作】

1.电泳槽的准备　将缓冲液加入电泳槽的两槽内，并使两槽液面同一水平。两槽内侧边各贴挂4层脱脂纱布浸入缓冲液中，构成盐桥（图26-2）。

图26-2　电泳槽装置示意图

2.薄膜的准备　于2 cm×8 cm的醋纤薄膜无光面一端约1.5 cm处用铅笔划一直线，表示点样位置，同时作一编号标记。将膜的有光泽面向下，浸入巴比妥缓冲液中，待充分浸透后即薄膜无白斑（约20min）取出，用滤纸轻轻吸去薄膜表面多余的缓冲液。(www.xing528.com)

3.点样　用加样器取新鲜血清约5μl，直接“印”于点样线上，将已点好样的薄膜平整地贴于电泳槽的盐桥上，无光泽面向下，点样端置电泳槽的阴极端。盖好电泳槽盖，平衡5min。接通电源，以电压8～10 V/cm膜长或电流0.4～0.6mA/cm膜宽，通电45～60min后关闭电源。

4.染色与漂洗　用镊子取出薄膜条直接浸入染色液中染色3～5min，取出，依次置于甲、乙、丙3瓶漂洗液中漂洗，直到背景漂洗净为止，可见5条蛋白着色带。

5.透明　若保存薄膜，待膜干燥后，置透明液中10～20min，取出贴于玻璃板上，干后即透明，可长期保存。

6.定量　将漂净的薄膜用滤纸吸干，将蛋白区带分段剪下，另剪一条约平均于五条蛋白区带的空白薄膜，共6条，分别浸入盛有洗脱液的试管中，其中清蛋白管加洗脱液4ml，其余各管加2ml，置室温30min，不时振摇，待色泽完全浸出，用分光光度计，在波长620 nm处比色，以空白调零，读出各管吸光度（也可直接将染色和干燥好的膜条放入专业扫描仪中扫描定量）。

【结果计算】 吸光度总和T=2AAlb+Aα1+Aα2+Aβ+Aγ

各组分蛋白质的百分数：

若需求各组分蛋白质的绝对值（g/L），可同时测定血清总蛋白浓度后相乘即可。

【临床意义】

1.参考值范围　清蛋白：55％～74％；α1球蛋白：0.8％～3.2％；α2球蛋白：4.5％～9.0％；β球蛋白：5.8％～12％；γ球蛋白：10％～19％。

2.血清蛋白电泳的病理改变　血清蛋白电泳的病理改变有一种或几种组分降低或增加的情况，对某些疾病有一定诊断价值（见图26-1B）。

【思考题】

1.血清点样端应置于电泳槽的哪一端，为什么？

2.写出电泳结果自阳极端至阴极端的蛋白质组分顺序。