DNA复制体系：功能、过程与机制

DNA复制是一个复杂的核苷酸聚合酶促反应过程，需要模版、合成原料、有关酶类及蛋白质因子参与完成，由ATP和GTP提供能量。

（一）参与复制的原料

三磷酸脱氧核苷是合成DNA的原料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP，且数量上前两者相等，后两者相等。

（二）参与复制的酶类

1.DNA聚合酶　又称为DNA指导下的DNA聚合酶（DNA directed DNA polymerase，DDDP），在适量DNA作模板、RNA作引物的条件下，可催化四种dNTP聚合成DNA，故称之为DNA指导的DNA聚合酶。把先发现者称DNA聚合酶I（DNA polI，DDDI），后发现者分别称为DNA聚合酶Ⅱ（DNA polⅡ，DDDPⅡ）和DNA聚合酶Ⅲ（DNA polⅢ，DDDPⅢ）。

原核生物大肠埃希菌的DNApolI是一种多功能酶，具有以下功能：

图21-3　大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅲ

A.DNA聚合酶Ⅲ；B.DNA聚合酶Ⅰ由18个α螺旋区组成；H和Ⅰ之间是较大的非螺旋区连接，图中未显示出

（1）催化新合成的DNA链由5′→3′方向延长。

（2）能识别并按3′→5′方向切除DNA片段或引物的3′末端的错误配对碱基。

（3）在复制过程中按5′→3′方向切除引物，并在引物切除后的空缺延长DNA片段。还有修复DNA损伤的作用。

DNA polⅡ因含量少（＜100个分子/细胞）、活性低（仅有DNA polI的5％），功能尚难定论。

DNA polⅢ活性最大，每分子酶每分钟可使1.5万～6.0万个脱氧核苷酸聚合，是真正的DNA复制酶。大肠埃希菌DNA polIII是由10种共22个亚基组成的不对称二聚体（图21-3）。不对称二聚体的酶结构有利于其在复制叉上同时催化先导链和随从链的合成。(www.xing528.com)

真核生物细胞中已发现α、β、γ、σ、ε5种DNA聚合酶，其中α是合成随从链，β是损伤修复酶，γ是线粒体DNA复制的酶，σ参与复制时合成先导链，ε功能还不很清楚。

DNA pol的主要作用是催化形成磷酸二酯键，具有3个特点：①只有模板DNA存在时才有酶活性，而且底物必须是dNTP。②只能在原有的DNA片段或RNA引物片段的3′-OH端上连续逐个加上脱氧核苷酸，延长DNA链。③聚合反应的延长方向是由5′→3′，即子链按5′→3′延长，模板按3′→5′被复制。

2.解链和解旋酶类　DNA分子是双螺旋结构，原核细胞环状DNA还形成超螺旋结构，真核细胞则更复杂。在双螺旋链中，碱基皆在两链之间，如果不解开复杂的螺旋和双链，碱基就不能外露，无法进行复制。故需要解旋、解链的酶类和蛋白质参与。

（1）DNA解链酶（DNA unwinding enzyme）：也称rep蛋白，此酶通过水解ATP获得能量，解开双螺旋链间氢键成单链DNA。恰在复制叉前解开一小段DNA，并沿复制叉前进的方向移动。

（2）单链结合蛋白（single-strand binding protein）：又称DNA结合蛋白（DNA binding protein），在DNA复制时，一旦较短的单股DNA链形成，几分子单链结合蛋白立即牢固地结合上去，防止以解链的单链再恢复成双链，并对抗核酸酶、保护单链不被破坏。此蛋白在复制过程中可反复被利用（图21-4）。

图21-4　单链DNA结合蛋白在复制过程中反复使用

（3）拓扑异构酶（topoisomerase）：DNA在解旋解链过程中，由于旋转速度过快，容易造成打结、缠绕、连环现象。①拓扑异构酶Ⅰ的功能包括：能迅速使环状超螺旋DNA解旋，而不改变其化学组成。作用机制可能是先切开双链DNA中的一条链，此切口的游离磷酸基与酶分子结合，使该链末端沿螺旋轴按超螺旋反方向转动，消除超螺旋后再将切口封闭，无需ATP供能。②拓朴异构酶Ⅱ有两个亚基，一个同时切断DNA双股链；另一个可水解ATP释放出能量。前者切开双链后使之反超螺旋方向转动以消除超螺旋，在无ATP时即重新封闭；后者水解ATP释出能量，使双链按反超螺旋方向再旋转，形成负超螺旋后再封闭之（图21-5）。

图21-5　拓扑异构酶Ⅱ作用示意图

3.DNA连接酶（DNA　ligase） 可催化两个DNA片段通过磷酸二酯键连接起来。反应需ATP供能（图21-6）。

图21-6　DNA连接酶的作用

图上方是双链状态下连接酶的作用，图下方把被连接的缺口放大，表示出化学反应

4.引物酶（primase）和引发体（primosome）　由于DNA聚合酶只能在引物RNA或DNA的3′-OH端，按5′→3′方向催化连续合成DNA，故必须由引物酶（dnaG蛋白）、解螺旋酶（dnaB蛋白）、dnaC蛋白和DNA起始复制区形成复合结构，称为引发体。引发体可移动，到达起始原点DNA变构，按照模版的配对序列，催化NTP聚合形成RNA引物。