氧化磷酸化产生ATP的关键底物及偶联位置

（一）呼吸链

代谢物脱下的成对氢原子（2H）通过线粒体内膜的酶和辅酶催化的连锁反应逐步传递，最终与氧结合生成水。由于此过程与细胞呼吸相似，故称呼吸链（respiratory chain）。在呼吸链中，酶和辅酶按一定顺序排列在线粒体内膜上，其中传递氢的称递氢体，传递电子的称电子传递体。不论递氢体还是电子传递体都起着传递电子的作用，所以呼吸链又称电子传递链（electron transfer chain，ETC）。

1.呼吸链的组成　用胆酸、脱氧胆酸等反复处理线粒体内膜，可将呼吸链分离得到四种仍具有传递电子功能的酶的复合体。这四种复合体分别为：NAD+-CoQ还原酶（NADH脱氢酶）、琥珀酸-CoQ还原酶（琥珀酸脱氢酶）、CoQ-细胞色素c还原酶、细胞色素氧化酶（图15-4）。

图15-4　人线粒体呼吸链复合体的组成

（1）复合体Ⅰ（NADH-CoQ还原酶）：复合体Ⅰ呈“L”形，其中L的一个臂埋在线粒体内膜中，另一臂伸展到线粒体基质。NADH+H+将2e和2H+传给FMN，FMN通过一系列的铁硫中心（Fe-S），将电子传给泛醌。在此过程中从线粒体基质向胞质泵出4H+。

NAD+与NADP+是烟酰胺脱氢酶类的辅酶，FMN是黄素酶的辅酶。Fe-S含有等量的铁原子和硫原子，其形式有Fe2S2（S1）、Fe4S4（S2和S3，S3作用不明），通过其中的铁原子与铁硫蛋白中半胱氨酸残基的硫相连接。

铁硫蛋白中的铁原子可进行而传递电子，在复合体Ⅰ中，其功能是将FMN的电子传递给辅酶Q。它只具有传递电子的功能。

辅酶Q（CoQ）即泛醌，是一种脂溶性醌类化合物。泛醌接受1个电子和1个质子还原成半醌，再接受1个电子和1个质子还原成二氢泛醌，后者又可脱去电子和质子而被氧化为泛醌。人体的CoQ侧链（-R）由10个异戊间二烯单位组成，用CoQ10表示。反应式如下：

目前认为复合体Ⅰ中电子传递顺序为：NADH→FMN→Fe-S→CoQ。

（2）复合体Ⅱ（琥珀酸-辅酶Q还原酶）：将电子从琥珀酸传递给泛醌。细胞色素（Cytochrome，Cyt）是一类以血红素为辅基的电子传递蛋白，血红素中的铁原子可进行Fe2++e反应传递电子，属于单电子传递体。还原型细胞色素（Fe2+）均有特殊的吸收光谱而呈现颜色。根据它们吸收光谱不同，参与呼吸链组成的细胞色素有细胞色素a、b、c三类，每一类中又因其最大吸收峰的微小差异再分为几种亚类。

复合体Ⅱ中电子传递顺序为：琥珀酸→FAD→Fe-S→CoQ。

（3）复合体Ⅲ（泛醌-细胞色素c还原酶）：将电子从还原型泛醌传递给细胞色素c。人复合体Ⅲ中含有2种细胞色素b（Cytb562、Cytb566）、细胞色素c1和Fe2S2。Cytc是膜周围蛋白，呈球状，水溶性，与线粒体内膜外表面结合不紧密，极易与线粒体内膜分离，故不包含在上述复合体中。由于它与泛醌和NAD+一样，能自由扩散，故能交互地与复合体Ⅲ的细胞色素c1和复合物Ⅳ接触起传递电子的作用。

（4）复合体Ⅳ（细胞色素氧化酶）：将电子从细胞色素c传递给氧。人复合体Ⅳ中含有Cyta和Cyta3。由于两者结合紧密，很难分离，故称之为Cytaa3。Cytaa3中含有2个血红素辅基和2个铜原子，2个铜原子分别与2个血红素辅基相连。铜原子可进行Cu+Cu2++e反应传递电子。

2.呼吸链的类型　呼吸链按其组成成分、排列顺序和功能上的差异分为两种类型：NADH氧化呼吸链和琥珀酸氧化呼吸链。

两条呼吸链成分的排列顺序是由一系列实验确定的：测定呼吸链各组分的标准氧化还原电位，由低到高顺序排列（电位低容易失去电子）是其中之一（表15-2）。

表15-2　呼吸链中各种氧化还原对的标准氧化还原电位

注：ΔE°′表示在pH=7.0、25℃、1mol/L反应物浓度条件下测得的标准氧化还原电位

电子只能从电子亲和力低（氧化能力弱）的电子传递体向电子亲和力高（氧化能力强）的传递体传递。测定各电子传递体的标准氧化还原电位（ΔE°′）值，即可测出其氧化能力强弱。ΔE°′值越小（负值越大或正值越小）的电子传递体供电子能力越大，处于电子传递链的前列。

线粒体内主要有两条氧化呼吸链（图15-5）如下。

（1）NADH氧化呼吸链：生物氧化中大多数脱氢酶如乳酸脱氢酶，苹果酸脱氢酶都是以NAD+为辅酶的。NAD+接受氢生成NADH+H+，然后通过NADH氧化呼吸链将其携带的2个电子逐步传递给氧。即NADH→复合体Ⅰ→泛醌→复合体Ⅲ→Cytc→复合体Ⅳ→O2（图15-5）。

（2）琥珀酸氧化呼吸链：琥珀酸由琥珀酸脱氢酶催化脱下的2H经复合体Ⅱ（FAD，Fe-S，b560）使CoQ形成CoQH2，再往下的传递与NADH氧化呼吸链相同。α-磷酸甘油脱氢酶及脂酰CoA脱氢酶催化代谢物脱下的氢也由FAD接受，通过此呼吸链被氧化。即琥珀酸→复合体Ⅱ→泛醌→复合体Ⅲ→Cytc→复合体Ⅳ→O2（图15-5）。

脱氢经过NADH氧化呼吸链的底物有乳酸、丙酮酸、β-羟基脂酰CoA、异柠檬酸、α-酮戊二酸、苹果酸等；经过琥珀酸氧化呼吸链的底物有琥珀酸、α-磷酸甘油、脂酰CoA等。

图15-5　电子传递呼吸链

（二）氧化与磷酸化偶联——ATP生成(www.xing528.com)

氧化磷酸化包括两个同时进行的过程：氧化过程中脱下的还原氢经电子传递链传给氧生成水；磷酸化过程将电子传递时释放的能量通过ATP合成酶使ADP磷酸化生成ATP。氧化磷酸化作用使氧化过程释放的能量得到有效的利用，以此方式生成ATP量占其总量的80％，氧化磷酸化是体内ATP生成最重要的来源。

氧化磷酸化的偶联部位，可通过计算各阶段所释放的自由能的实验方法大致确定，也可通过测定P/O比值，即每消耗1摩尔氧原子时ADP磷酸化摄取无机磷酸的摩尔数推导。近年来实验确定NADH呼吸链P/O比值大约为2.5，琥珀酸呼吸链P/O比值约1.5。

实验证明：电子传递链中氧化磷酸化的偶联部位是NADH和CoQ之间、细胞色素b到细胞色素c之间、细胞色素aa3与O2之间。因此，一对电子由NADH进入电子传递链传递到氧生成水产生2.5分子ATP；FADH2是把电子传递给CoQ，所以一对电子从FADH2传递给氧生成水只能产成1.5分子ATP（图15-6）。

图15-6　电子传递链与氧化磷酸化的偶联部位

（三）影响氧化磷酸化的因素

1.ADP的调节作用　影响氧化磷酸化速度的主要因素有：O2、底物、Pi和ADP，正常生理情况下O2、底物、Pi不易缺乏，故氧化磷酸化的速率主要受ADP的调节。当机体利用ATP增多，ADP浓度增高，转运入线粒体后使氧化磷酸化速度加快；反之ADP不足，使氧化磷酸化速度减慢。这种调节作用可使ATP的生成速度适应生理需要。用离体线粒体进行实验，当有过量底物存在时，加入ADP后的耗氧速率与仅有底物时的耗氧速率之比称为呼吸控制率。它可以作为氧化磷酸化偶联程度较敏感的指标。

2.甲状腺激素的作用　甲状腺激素诱导细胞膜上Na+，K+-ATP酶的生成，使ATP加速分解为ADP和Pi，ADP增多促进氧化磷酸化，甲状腺激素（T3）还可使解偶联蛋白基因表达增加，因而引起耗氧和产热均增加。所以甲状腺功能亢进症患者基础代谢率增高。

3.抑制剂的作用

（1）解偶联剂：使底物氧化过程与ADP磷酸化的偶联作用分离的物质称解偶联剂。可使氧化于磷酸化偶联过程脱离。典型的解偶联剂是脂溶性物质2，4-二硝基苯酚（2，4-DNP）。作用机制是破坏呼吸链传递电子过程中建立的内膜内外的质子梯度，使质子电化学梯度储存的能量以热能形式释放，ATP生成受到抑制。

（2）ATP合成酶抑制剂：这类抑制剂对电子传递及ADP磷酸化均有抑制作用。例如，寡霉素作用与ATP合成酶阻止质子从F0质子半通道回流，ATP不能释放。此时由于线粒体内膜两侧电化学梯度增高影响呼吸链将质子向内膜外侧转移，继而抑制电子传递。

（3）呼吸链抑制剂：由于电子传递阻断使物质氧化过程中断，磷酸化也无法进行，故呼吸链传递抑制剂同样也可抑制氧化磷酸化。

现已知的呼吸链抑制剂有以下几种：鱼藤酮、粉蝶霉素A、异戊巴比妥等与复合体Ⅰ中的铁硫蛋白结合，从而阻断电子的传递。抗霉素A抑制复合体Ⅲ中的Cyt b与Cyt c1间的电子传递。CO、CN-、N3-等抑制细胞色素氧化酶，牢固地结合，阻断电子传递至氧的作用。目前城市火灾中，由于装饰材料中的N和C经高温可形成HCN，因此可造成烧伤者CO、CN-中毒。呼吸链受到抑制，使细胞不能利用O2，呼吸停止，供能物质不能释放能量生成ATP，生命活动停止，机体迅速死亡。

呼吸链抑制剂的作用部位归纳于图15-7。

图15-7　电子传递链抑制作用点

（四）线粒体外NADH的氧化

在细胞液中生成的NADH不能自由透过线粒体内膜，必须通过某种转运机制才能进入线粒体，然后再经呼吸链进行氧化磷酸化。这种转运机制主要有α-磷酸甘油穿梭（glycerophosphate shuttle）和苹果酸穿梭（malate-asparate shuttle）两种。

（1）α-磷酸甘油穿梭：指通过α-磷酸甘油将细胞液中NADH+H+带入线粒体内的过程。这种穿梭主要存在于脑和骨骼肌中（图15-8）。磷酸二羟丙酮在细胞液α-磷酸甘油脱氢酶的催化下，由NADH+H+供氢生成α-磷酸甘油，后者进入线粒体后在线粒体内α-磷酸甘油脱氢酶催化下重新生成磷酸二羟丙酮和FADH2。磷酸二羟丙酮穿出线粒体外可继续利用。而FADH2则进入FADH2氧化呼吸链被氧化，生成1.5分子的ATP。

（2）苹果酸穿梭：指通过苹果酸将细胞液中NADH+H+带入线粒体内的过程。这种穿梭主要存在于心肌和肝中（图15-9）。细胞液中生成的NADH+H+在苹果酸脱氢酶催化下，使草酰乙酸还原成苹果酸。苹果酸在线粒体内膜转位酶的催化下穿过线粒体内膜，进入线粒体的苹果酸在苹果酸脱氢酶作用下脱氢生成草酰乙酸，并生成NADH+H+。生成的NADH+H+通过NADH呼吸链进行氧化，生成2.5分子的ATP。

图15-8　α-磷酸甘油穿梭机制

图15-9　苹果酸穿梭机制

1.苹果酸脱氢酶；2.谷草转氨酶；3、4.转位酶

草酰乙酸不能直接透过线粒体内膜返回细胞液，但它可在谷草转氨酶作用下从谷氨酸接受氨基生成天冬氨酸，谷氨酸脱掉氨基后生成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸、天冬氨酸都能在线粒体内膜转位酶的作用下穿过线粒体内膜而进入细胞液，在细胞液中天冬氨酸和α-酮戊二酸在谷草转氨酶的作用下又重新生成草酰乙酸和谷氨酸，草酰乙酸又可重新参与苹果酸穿梭。