氨基酸二硫键形成及氨基酸旋光性分析

蛋白质是一类大分子物质，可以在酸、碱或蛋白酶的作用下水解为小分子物质。蛋白质彻底水解后，能得到其基本组成单位——氨基酸（amino acid）。存在于自然界中的氨基酸有300余种，但是参与构成蛋白质的氨基酸通常有20种，并且它们均属于L-α-氨基酸（甘氨酸除外）。这些氨基酸以不同的连接顺序通过肽键连接起来构成蛋白质。

一、氨基酸的组成、结构与分类

组成蛋白质的20种氨基酸的结构有共同的特点。蛋白质水解得到的氨基酸都是α-氨基酸（其中，脯氨酸为α-亚氨酸），氨基连接在α碳原子上，它可用下面的结构通式表示。结构通式如图3-1所示，其中，R称为氨基酸的侧链基团。

图3-1　氨基酸的结构通式

不同氨基酸的R基团也各不相同，除了R为H原子的甘氨酸外，其他氨基酸的α碳原子都是手性碳原子，故它们都具有旋光性，存在D-型和L-型两种异构体，如图3-2所示。但是，组成天然蛋白质的氨基酸均为L-型。

图3-2　氨基酸的两种异构体

氨基酸的分类依据有多种，按照R基团的不同对其进行分类，可将氨基酸分为四类，如表3-2所示。

1.带负电荷的酸性氨基酸

在氨基酸的R基团中均含有一个羧基，在生理条件下，氨基酸的羧基完全解离使氨基酸本身带负电荷，故称为酸性氨基酸。这类氨基酸包括2种，即天冬氨酸（aspartic acid）和谷氨酸（glutamic acid）。

2.带正电荷的碱性氨基酸

由于氨基酸的R基团中均含有一个氨基，在生理条件下，氨基酸的氨基完全解离而使氨基酸本身带正电荷，故称为碱性氨基酸。这类氨基酸有3种，即赖氨酸（lysine）、精氨酸（arginine）和组氨酸（histidine）。

3.非极性或疏水性氨基酸

由于氨基酸的R基团是疏水性的，故称为非极性或疏水性氨基酸。这类氨基酸包括8种，即丙氨酸（alanine）、亮氨酸（leucine）、异亮氨酸（isoleucine）、缬氨酸（valine）、脯氨酸（proline）、甲硫氨酸（methionine）、苯丙氨酸（phenylalanine）和色氨酸（tryptophan）。

4.极性非解离氨基酸

由于氨基酸的R基团具有极性，但在中性溶液中不解离，故称为极性非解离氨基酸。这类氨基酸有7种，即甘氨酸（glycine）、半胱氨酸（cysteine）、丝氨酸（serine）、苏氨酸（threonine）、天冬酰胺（asparagine）、谷氨酰胺（glutamine）和酪氨酸（tyrosine）。

表3-2　氨基酸的分类

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上述氨基酸中，脯氨酸和半胱氨酸结构较为特殊。脯氨酸属于α-亚氨基酸，但其亚氨基仍能与另一羧基形成肽链。在蛋白质合成加工时，脯氨酸可被修饰成羟脯氨酸。此外，2个半胱氨酸通过脱氢后可以二硫键的形式结合，形成胱氨酸。蛋白质中有不少半胱氨酸以胱氨酸形式存在。

除上述20种氨基酸外，从蛋白质水解物中还分离出一些其他的氨基酸。例如，胶原蛋白中含有羟基脯氨酸和5-羟基赖氨酸，弹性蛋白中含锁链素（desmosine）和异锁链素（isodesmosine），肌肉蛋白中存在甲基组氨酸、ε-N-甲基赖氨酸和ε-N-三甲基赖氨酸。这些氨基酸从化学结构上看都是属于上述的常见氨基酸的衍生物。另外，还有一些氨基酸是代谢的中间产物或前体，或在神经传递过程中有重要作用。

二、氨基酸的物理性质

氨基酸为无色晶体，熔点超过200℃，比一般有机化合物的熔点高很多。α-氨基酸有酸、甜、苦、鲜4种不同味感。谷氨酸单钠盐和甘氨酸是用量最大的鲜味调味料。氨基酸一般都溶于水、酸溶液和碱溶液中，不溶或微溶于乙醇或乙醚等有机溶剂。氨基酸在水中的溶解度差别很大，例如酪氨酸的溶解度最小，25℃时，100 g水中酪氨酸仅溶解0.045 g，但在热水中酪氨酸的溶解度较大。赖氨酸和精氨酸常以盐酸盐的形式存在，因为它们极易溶于水，因潮解而难以制得结晶。

（一）旋光性

除甘氨酸外，大多数氨基酸的α-碳原子是不对称的手性碳原子，所以大多数氨基酸都具有旋光性（rotation），其旋光性方向和大小不仅与侧链R基的性质有关，还与水溶液的pH、温度等介质条件有关。氨基酸的旋光性可以用于它们的定量分析和定性鉴别。一些氨基酸的比旋光度如表3-3所示。

表3-3　氨基酸的比旋光度

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（二）氨基酸的紫外吸收和荧光

常见的20种氨基酸在400～780nm可见光区域内均无吸收。但由于羧基的存在，所有氨基酸在紫外光区的短波长210nm附近均有弱的吸收。酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸由于含有芳香环，分别在278nm、279nm和259nm处有较强的吸收，摩尔吸光系数ε分别为1400L·mol-1·cm-1、5600L·mol-1·cm-1、200L·mol-1·cm-1，可以利用这个性质对这三种氨基酸进行分析测定。酪氨酸、色氨酸结合后的残基等同样在280 nm附近有最大的吸收，故紫外分光光度法同样也可以用于蛋白质的定量分析。

酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸也能受激发而产生荧光，激发后它们可在304 nm、348 nm和282 nm分别测定其荧光强度，而其他的氨基酸则不产生荧光。

（三）氨基酸的酸碱性质

氨基酸的离子化能力是非常重要的，这一性质可用于氨基酸的定量分析。另外，氨基酸的一些性质（熔点、溶解度、偶极矩及在水溶液中的介电常数）都是由于在水溶液中的电荷分布不均匀而产生的。因此，在接近中性pH的水溶液中，所有氨基酸主要以两性离子（zwitterion），也称偶极离子（dipolor ion）的形式存在，如图3-3所示。

图3-3　氨基酸偶极离子

在不同的pH条件下，氨基酸既可作为碱接受一个H+，又可作为酸离解出一个H+，因此，一个单氨基单羧基氨基酸全部质子化以后，可将其看作一个二元酸，存在两个离解常数pKa1和pKa2，分别对应于羧基和氨基的离解。当氨基酸侧链还有另外的可离解基团时，例如碱性氨基酸或酸性氨基酸的ε-氨基、ε-羧基，此时，氨基酸就具有了第三个离解常数pKa3。

当氨基酸分子在溶液中呈电中性时（即净电荷为零，氨基酸分子在电场中不运动），此时，溶液的pH即为该氨基酸的等电点（pI, isoelectric point）。在等电点时，氨基酸的溶解性能最差，容易从溶液中沉淀析出。一个单氨基单羧基的氨基酸，其pI与pKa1、pKa2的关系为2pI=pKa1+pKa2；碱性氨基酸的pI与pKa2、pKa3的关系为2pI=pKa2+pKa3；酸性氨基酸的pI与pKa1、pKa3的关系为2pI=pKa1+pKa3。常见氨基酸的pKa值和pI值（25℃）如表3-4所示。

表3-4　常见氨基酸的pKa和pI（25℃）

（四）氨基酸的疏水性

蛋白质在水中的溶解度同氨基酸侧链的极性基团（带电荷或不带电荷）和非极性（疏水）基团的分布状态有关，同时蛋白质和肽的结构、溶解性及结合脂肪的能力等许多物理化学性质，都与其所含有的氨基酸的疏水性有关。

氨基酸的疏水性（hydrophobicity）定义为将1 mol氨基酸从乙醇溶液中转移到水溶液中时所产生的自由能变化。在忽略活度系数变化的情况下，此时体系的自由能变化为：(www.xing528.com)

ΔG°=-RTln（S水/S乙醇）

式中：S乙醇为氨基酸在乙醇中的溶解度，（mol/L）；S水为氨基酸在水中的溶解度，（mol/L）。

氨基酸分子中有多个基团，则ΔG°应该是氨基酸中多个基团的加和函数，即有：

ΔG°=∑ΔGi°

如果将氨基酸分子分为两个部分，一部分是甘氨酸基，另一部分是侧链（R），并设定甘氨酸的侧链（此时R=H）的ΔG°为零，则有：

ΔG°=ΔG°（侧链）+ΔG°（甘氨酸）

因此，任何一种氨基酸侧链残基的疏水性就为ΔG°（侧链）=ΔG°-ΔG°（甘氨酸）。

目前，食品化学中常用Tanford法来确定氨基酸侧链的疏水性大小。常见氨基酸侧链的疏水性如表3-5所示。

表3-5　氨基酸侧链的疏水性（25℃，乙醇—水，Tanford法）

如果疏水性数值是较大的正值，意味着氨基酸的侧链是疏水的，在蛋白质结构中该残基倾向分布于分子的内部；而疏水性数值是较大的负值，则意味着氨基酸的侧链是亲水的，在蛋白质结构中倾向分布于分子的表面。但是，赖氨酸却是一个例外，它是一个亲水性的氨基酸，而其疏水性数值为正值，这是因为赖氨酸的分子中含有4个易溶于有机相的亚甲基。这些数据也可用于预测氨基酸在疏水性载体上的吸附行为，因为吸附吸收与疏水性程度成正比。

三、氨基酸的化学性质

氨基酸分子中的官能团都可以进行多种化学反应，既有氨基参与的反应，也有羧基参与的反应，还有侧链基团参与的反应。

（一）氨基的反应

1.与亚硝酸的反应

α-氨基酸的α-NH2能定量与亚硝酸作用，产生氮气和羟基酸。

只要测定N2的体积就可以得到样品中氨基酸的含量。与α-NH2不同，ε-NH2与HNO2反应较慢，脯氨酸的α-亚氨基则不与HNO2反应，精氨酸、色氨酸和组氨酸的分子中被环结合的氮也不能与HNO2反应。

2.与醛类化合物的反应

氨基酸的α-氨基可与醛类化合物发生反应，生成Schiff碱类化合物，Schiff碱则是美拉德反应的重要中间产物。

3.酰基化反应

氨基酸的α-氨基与苄氧基甲酰氯在弱碱性条件下反应，则生成氨基衍生物，此反应可用于肽的合成。

4.烃基化反应

氨基酸的α-氨基可以与2，4-二硝基氟苯反应，生成稳定的黄色化合物，此反应可用于氨基酸、蛋白质中末端氨基酸的分析。

（二）羧基的反应

1.酯化反应

氨基酸在干燥HCl存在条件下，能够与无水甲醇或乙醇作用生成甲酯或乙酯。

2.脱羧反应

大肠杆菌中含有谷氨酸脱羧酶，这种酶可作用于谷氨酸使其发生脱羧反应。该反应通常用于味精中谷氨酸钠的含量分析。

（三）由氨基与羧基共同参与的反应

1.形成肽键

一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基之间发生缩合反应，脱去一分子水，则形成肽键（peptide bond），此反应过程是形成蛋白质的物质基础。

2.与茚三酮的反应

氨基酸的α-氨基酸与茚三酮在碱性溶液中共热会发生反应，最终生成蓝紫色的化合物，这类化合物通常在570 nm处有最大吸收。此反应可用于氨基酸的定性和定量分析。脯氨酸因其分子结构中含有α-亚氨基，它与茚三酮共热后，生成物为黄色的化合物，此化合物通常在440 nm处有最大吸收。

（四）侧链的反应

α-氨基酸的侧链R基的反应很多，例如R基上含有酚基时可还原Folin—酚试剂，生成钼蓝和钨蓝。如果R基上含有—SH基，可氧化生成二硫键；而在还原剂存在条件下，二硫键也可被还原，重新变成—SH基，这个反应在蛋白质功能性质等方面具有重要作用。

氨基酸或蛋白质的定性鉴别中，有一些涉及氨基酸的侧链基团的重要化学反应，见表3-6。

表3-6　氨基酸（蛋白质）的一些重要颜色反应