部分亚硝化-厌氧氨氧化耦合脱氮机理及应用

（一）测序结果质量分析

各样品的测序结果统计如表6-1所示。由表6-1可知，通过对PN反应器内不同滤料高度5组样品的测序，共获得原始序列253321条，通过拼接、质量过滤、嵌合体去除后，得到有效序列共计230450条，所有样品的有效序列比均高于90%。在Qiime中按照相似度0.97对5组样品的优质序列进行聚类分析，获得5组样品在不同OTU中的丰度信息，PN1～PN5包含的OTU条数分别为1735、2011、2093、1927、1859，共计9625条，其中PN1的OTU数最少，PN3的OTU数最多。

表6-1　样品测序数据统计（PN反应器）

从5组滤料样品中随机抽取一定数量的序列，统计出这些序列数所能代表的物种数目，以样品序列数为横坐标、测序条数对应的OTU数为纵坐标，构建出如图6-1所示的稀释曲线。稀释曲线可以反映样品的取样深度，由图6-1可知，5组样品的稀释曲线在97%相似水平下均趋于平坦，说明测序深度合理[201]，更多的测序量对发现新OTU的边际贡献不大，该测序结果能较真实地反映滤料样品中的微生物群落结构。

图6-1　样品的稀释曲线（PN反应器）

（二）菌群丰度和多样性分析

Chao1指数通常用来反映菌群的丰度，Chao1指数值越大，表明样品中菌群的丰度越高；Shannon和Simpson指数通常用来反映菌群的多样性，Shannon指数值越大，表明样品中菌群的多样性越高，而Simpson指数值越大，则表明样品中菌群的多样性越低[202.203]。各样品的SChao1、HShannon、DSimpson如表6-2所示，其中HShannon的范围为7.194～7.811。赵志瑞等[204]分析了短程硝化A/O反应器处理高NH+4-N浓度废水和城市生活污水时活性污泥的菌群多样性，两者的HShannon分别为1.24和1.41；王秀杰等[205]采用MBR反应器实现了亚硝化并用于晚期垃圾渗滤液的处理，通过克隆文库分析了该体系在稳定运行期的微生物多样性，统计得到HShannon为2.5282。本研究中的HShannon处于较高值，这是由于PN反应器采用不同类型的滤料进行填充，对微生物具有良好的截留能力，同时淹水-落干的交替运行方式使得滤料层间产生不同的微生态环境，为不同类型的微生物提供了适宜的生存空间，因而菌群表现出复杂的多样性。

表6-2　样品微生物群落多样性指数（PN反应器）

从不同滤料层位来看，SChao1的大小顺序为PN3>PN2>PN4>PN5>PN1，HShannon的大小表现出同样的规律，而DSimpson的大小则呈现出相反的规律，即PN1>PN5>PN4>PN2>PN3，这说明PN反应器内菌群的丰度和多样性随着滤料深度的增加呈现出先增大（0～45 cm滤料段）后减小（45～75 cm滤料段）的趋势。分析认为，0～15 cm滤料段处于进水区下方，污染物浓度相对较高且存在一定的波动，微生物受到的负荷冲击相对较大，该区域不是微生物生存的最佳环境，因此菌群的丰度和多样性相对较低；下渗至15～45 cm滤料段后，污水中的污染物形态更加丰富、环境条件更加稳定，有利于生物膜上微生物的生长繁殖，因而菌群的丰度和多样性逐渐增加；而随着污染物的逐级消耗，能被微生物利用的污染物数量随着滤料深度的继续增加而减少，故45～75 cm滤料段的菌群丰度和多样性又逐渐下降。

对不同滤料层位样品的OTU组成进行PCoA分析，得到图6-2，图中主成分1（PCoA1）和主成分2（PCoA2）的贡献率分别为60.11%和16.79%，点代表样品PN1～PN5，点与点之间的距离表示OTU组成的差异程度[206]。由图可知，PN1与其他样品之间的距离较远，距离大小排序为：LPN1-PN2>LPN1-PN3>LPN1-PN4>LPN1-PN5，说明0～15 cm滤料层的微生物群落结构与其他滤料层差异较大，且这种差异随着滤料深度的增加而增大；PN2和PN3之间的距离较近，说明15～30 cm和30～45 cm滤料层OTU的组成相近；PN4和PN5之间的距离相近，说明45～60 cm和60～75 cm滤料层的菌群结构差异较小。

图6-2　基于加权Unifrac距离的PCoA图（PN反应器）

（三）菌群结构及分布分析

1.门水平(www.xing528.com)

从5组滤料样品共检出39个已知菌门，可见PN反应器内的微生物多样性较高。由图6-3所示的主要门水平菌群结构及分布情况可知，相对丰度较高的主要包括变形菌门（Proteobacteria，73.51%～80.23%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，2.92%～6.58%）、放线菌门（Actinobacteria，1.68%～5.73%）、酸杆菌门（Acidobacteria，1.01%～4.21%）、泉古菌门（Crenarchaeota，1.27%～3.63%），其次是绿弯菌门（Chloroflexi，1.35%～1.86%）、厚壁菌门（Firmicutes，0.67%～2.35%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes，0.63%～1.54%）、浮霉菌门（Planctomycetes，0.87%～1.81%）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae，0.17%～0.82%）。从PN反应器内不同滤料层位的菌群分布来看，Proteobacteria在5组样品中的相对丰度高低为PN3>PN2>PN4>PN5>PN1，Bacteroidetes、Actinobacteria和Crenarchaeota在5组样品中的相对丰度高低为PN1>PN2>PN3>PN4>PN5，Acidobacteria在5组样品中的相对丰度高低为PN4>PN5>PN3>PN2>PN1，可见不同滤料样品的菌群丰度在门水平上存在明显差异，微生物的群落结构随着污染物在系统内的迁移转化而变化。

图6-3　主要门水平菌群结构及分布（PN反应器）

从分析结果可知，Proteobacteria在5组样品中的相对丰度最高，占绝对优势。Ansola等[207]分析了接纳城市污水的植被型人工湿地中的微生物群落结构，发现Proteobacteria的相对丰度水平最高，达到了50%～61%；郑林雪等[208]研究了细菌在缺氧/好氧-膜生物反应器的好氧池和缺氧池中的多样性，结果表明无论在好氧池还是缺氧池中，Proteobacteria所占比例均最大，分别为37.04%和27.91%；Liu等[209]研究发现SBR反应器内总细菌群落中丰度最大的是Proteobacteria，占比为36.4%；王鹏等[210]对鄱阳湖的湿地土壤菌群结构进行了分析，其中Proteobacteria在不同植被类型的土壤中均占据优势地位，平均相对丰度达到30%。本研究得到的结果与上述研究一致，即Proteobacteria是污水处理系统中的优势菌群。Proteobacteria是细菌域中最大的一门，该门的细菌形态多样、种类丰富，涵盖了好氧型、厌氧型、自养型、异养型、光能型、化能型等极为广泛的生理代谢类型，与多种有机物和无机物的代谢（如C、N和S循环）密切相关[211-213]，为PN反应器内污染物的高效去除或转化提供了基础。

Bacteroidetes在总菌群中的比例仅次于Proteobacteria，也是污水处理系统内较为常见的菌群类型[214]，它属于化能有机营养型菌，能够代谢碳水化合物或多种复杂有机物[215-218]。相对丰度排第三位的Actinobacteria，广泛存在于有机物含量丰富、呈中性或弱碱性的环境中[219]，对污水中有机物的降解起着积极作用。Acidobacteria主要分布于土壤、海洋沉积物或活性污泥体系内，Tank等[220]指出该细菌种群多分布于贫营养环境中。本研究中Acidobacteria的相对丰度随着滤料深度的增加而递增，这与滤料后半段营养物质减少而有利于其生长有关。20世纪70年代末，Woese等[221]提出了著名的三域学说（Three domain proposal），认为除细菌域（Bacteria）、真核生物域（Eucaryota）外，还应该包括生活于高温、高盐、低pH等极端环境中的古生菌域（Archaea），随着环境生物技术在微生物领域的深入，研究者相继在土壤[222]、湖泊[223]、草原[224]、淡水水体[225]、污水处理系统[226，227]等非极端环境或体系中也发现了大量古菌，本研究检测到的Crenarchaeota属于古菌域中的一个重要分支，其存在使整个系统的微生物多样性更加丰富，在C、N等物质的转化中有着重要意义[228]。

2.纲水平

从5个不同层位滤料样品中共检出113个已知菌纲，主要纲水平菌群的结构及分布情况如图6-4所示。由图可知，在群落组成中相对丰度较高的菌群主要有　β-变形菌纲（Betaproteobacteria）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、δ-变形菌纲（Deltaproteobacteria）、奇古菌纲（Thaumarchaeota）、Saprospirae、噬纤维菌纲（Cytophagia）、放线菌纲（Actinobacteria）、Chloracidobacteria、iii1-8、Sva0725等，其中　Betaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Deltaproteobacteria、Thaumarchaeota占比分别为56.26%～61.37%、3.97%～8.15%、5.19%～7.21%、2.10%～10.54%、1.09%～3.48%，在PN反应器内占据优势地位。

图6-4　主要纲水平菌群结构及分布（PN反应器）

Proteobacteria通常包括α-、β-、γ-、δ-、ε-变形菌纲5个类群，本研究中β-proteobacteria的相对丰度最高，ε-proteobacteria的相对丰度最低。王海燕等[229]研究了亚硝化/电化学生物反硝化系统中的细菌多样性，结果表明β-proteobacteria以78.33%～81.97%的相对丰度在所有菌群中占绝对优势；Hu等[230]采集了12座不同类型污水厂中的活性污泥进行分析，发现β-proteobacteria在纲水平上相对丰度处于较高值；严显超等[231]采用A/O连续流砂过滤器处理污水厂二级出水，发现β-proteobacteria是滤料表面生物膜中的优势菌种，相对丰度为38.27%；罗晓等[232]对A/O工艺污泥样品的微生物群落结构分析表明β-proteobacteria是变形门各纲中相对丰度最高的，占比为12.05%～20.67%。β-proteobacteria通常为好氧或兼性细菌，其中包含了Nitrosomonas、Nitrosovibrio、Thauera等多种与生物脱氮相关的菌类[233]，为PN反应器内氮素污染物的转化或降解提供了可能。另外，Thaumarchaeota在泉古菌门中占绝对优势，其在各滤层的相对丰度随着滤料深度的增加而减小。该类型古菌的基因组中含有amoA、amoB和amoC等功能基因[234，235]，能通过氨氧化过程中获取能量实现自养代谢[236，237]，因此又被称为氨氧化古菌（ammonia-oxidizing archaea，AOA），在污水生物脱氮中发挥着重要作用。

3.属水平

图6-5表示了不同滤料样品中主要属水平菌群的结构及分布情况。由5组滤料样品共检出281个已知菌属，其中相对丰度水平较高的包括隶属于Betaproteobacteria纲的亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）、陶厄氏菌属（Thauera）、硫杆菌属（Thiobacillus）、亚硝化弧菌属（Nitrosovibrio）和Uliginosibacterium，隶属于Deltaproteobacteria纲的土杆菌属（Geobacter）、脱硫叶菌属（Desulfobulbus）和Corallococcus，以及隶属于Thaumarchaeota纲的亚硝化短小杆菌属（Nitrosopumilus），而各层滤料样品中相对丰度较小以及未培养菌属的比例均达到70%以上，这表明少数常见的菌属在总群落中相对比例较高，而相对比例较低的菌群多样性差异显著，表现出复杂的多样性。

图6-5　主要属水平细菌群落结构及分布（PN反应器）

在上述属中，Betaproteobacteria纲中的Nitrosomonas、Nitrosovibrio是污水生物处理工艺中最为常见的AOB类型，Thaumarchaeota纲中的Nitrosopumilus则是具有氨氧化功能的AOA，它们均能将进水中的NH+4-N氧化为NO-2-N。Limpiyakorn等[238]对12个污水处理系统中活性污泥的氨氧化菌进行了调研，表明AOB中的优势菌均为Nitrosomonas；赵志瑞等[204]发现A/O短程硝化体系内活性污泥中的主要AOB菌包括Nitrosomonas、Nitrosospira；侯爱月等[239]采用SBR反应器处理模拟无机生活污水，所检测的污泥样品中优势AOB菌为Nitrosomonas，占比为22.5%；罗晓等[232]的研究也表明A/O工艺中相对丰度较高的AOB菌为Nitrosomonas。本研究中占优势的氨氧化功能菌类型相比上述研究更加丰富，这与PN反应器的滤料结构及运行方式密切相关。Nitrosomonas在PN1～PN5中的相对丰度依次为7.25%、7.18%、7.01%、6.72%、5.33%，Nitrosopumilus在PN1～PN5中的相对丰度依次为2.91%、1.65%、1.13%、0.59%、0.33%，Nitrosovibrio的占比相对较小，在PN1～PN5中的相对丰度依次为1.36%、1.28%、0.95%、0.71%、0.26%。由于污水在下渗过程中NH+4-N和DO浓度逐级下降，这些氨氧化菌属的相对丰度均表现出随着滤料深度的增加而递减的趋势。硝化螺旋菌属（Nitrospira）作为最常见的污水生物处理NOB类型，可将NO-2-N进一步氧化成NO3--N。然而，Nitrospira在PN1～PN5中的相对丰度分别仅为0.73%、0.45%、0.26%、0.21%、0.15%，仅相当于Nitrosomonas、Nitrosopumilus、Nitrosovibrio总丰度的2.53%～6.34%，这就印证了前期的饥饿-pH协同调控已成功选择性抑制了反应器内NOB的活性，使其生长代谢处于较低水平，因而细菌群落丰度也较低。AOB、AOA在反应器内占据绝对优势，导致亚硝化过程顺利进行而硝化过程受阻，NO-2-N无法被全部氧化成NO3--N而高效积累起来，因而PN反应器表现出显著的亚硝化特性。