基于加权Unifrac距离进行主坐标分析及统计分析

1.测序数据处理

对每组样品双端测序（paired-end）的reads进行拼接（FLASh，V1.2.7，http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/），得到原始Tags数据（Raw Tags）；根据Qiime（V1.9.0，http：//qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html）提供的Tags质量控制流程，对Raw Tags进行截取、长度过滤、嵌合体（chimera）去除（Usearch，v8.0，http：//drive5.com/uparse/）等处理后得到高质有效的Tags数据（effective Tags）。

2.OTU聚类和物种注释

采用Qiime软件对所有Effective Tags进行cd-hit去除冗余序列，以序列差异水平在0.03（即相似度97%）水平上将序列聚类成OTU（Operational Taxonomic Units ），同时选取OTU中出现频数最高的代表性序列，去除只含有一条序列的OTU（Singleton），对OTU代表序列进行物种注释（Greengenes，http：//greengenes.secondgenome.com/）。以样品中数据量最少的为标准，对OTU表中各样品的数据进行均一化处理，均一化处理后的数据进一步用作后续Alpha和Beta多样性分析。

3.Alpha多样性分析

通过样品的Alpha多样性分析可以反映样品内的微生物群落的丰富度和多样性，进而反映菌群结构的变化。本研究采用Qiime软件（Version 1.9.0）对Chao1、Shannon、Simpson等Alpha多样性指数进行计算并绘制稀释曲线，计算公式如下：

式中　SChao1、HShannon、DSimpson——Chao1、Shannon和Simpson指数；

Sobs——观测到的OTU数；(www.xing528.com)

N1——只含有一条序列的OTU数；

N2——只含有两条序列的OTU数；

N——抽样中出现的所有序列数；

Ni——含有i条序列的OTU数。

4.Beta多样性分析

Beta多样性反映不同群落间物种组成沿环境梯度的差异性。根据OTU表和系统发育树，采用Qiime软件生成Unifrac距离矩阵，绘制基于加权Unifrac距离的主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA）图，统计分析参照文献[200]。