太湖贡湖湾水源地蓝藻水华污染研究实验材料与方法

2009 年7 月15 日用25 号浮游植物网在太湖贡湖湾采集水华蓝藻， 然后用筛绢进一步浓缩后装在离心管中， 0 ℃保温箱中运回实验室。 实验室内除去藻样杂质， 用去离子水清洗两次， 最后溶入适量的去离子水中。 按鲜重比例取两份上述样品， 一份于105 ℃烘干测定藻样干重， 另一份反复冻融3 次， 14 000 r/min 离心10 min 后取上清液(粗提液)， 取少量过45 μm 醋酸纤维滤膜， 量取50mL 用C18固相萃取小柱富集浓缩后HPLC-UV 检测微囊藻毒素含量。 剩余的蓝藻粗提液于-20 ℃保存备用。

实验选用的杂交水稻(hybrid rice) 种子， 由中国科学院植物生理研究所惠赠。 种子萌发实验时分别取1 mL、 5 mL、 10 mL、 20 mL、 50 mL 蓝藻粗提液用去离子水定容至100 mL 分别配成0.01 倍、 0.05 倍、 0.1 倍、 0.2 倍、 0.5 倍5 组蓝藻粗提液备用液。

取规格为12 cm， 50 mL 的培养皿18 个， 挑选饱满、 大小均一的水稻种子约600 粒， 将水稻种子用5%NaClO 消毒液处理约10 min， 再经无菌水反复振荡冲洗3次， 每次3 ～5 min。 冲洗后取少许(10 粒左右) 种子用1%蔗糖(真菌) 和牛肉膏培养液(细菌) 进行无菌检验， 若培养液不出现浑浊， 则说明除菌成功。 分别在6 组[对照组(去离子水)、 A 组(0.01 倍蓝藻粗提液)、 B 组(0.05 倍蓝藻粗提液)、 C 组(0.1 倍蓝藻粗提液)、 D 组(0.2 倍蓝藻粗提液)、 E 组(0.5 倍蓝藻粗提液) (每组3 个平行) ] 18 个培养皿(每个培养皿需30 粒， 共540 粒种子)中加入含有不同浓度梯度蓝藻粗提液的水溶液30 mL。 于26 ℃光照培养， 光照时间为10 h/d； 20 ℃无光培养， 时间为14 h/d。 湿度60% ～85%， 光照强度4 000 ～6 000 lux， 每天添加10 mL 相应不同浓度的粗提液溶液。 在水稻种子萌发期间连续观测其萌发特征和形态特征(分别记录株高、 叶片数、 叶长等)。 种子萌发至出现根、 茎、 叶器官的分化时终止实验。

种子萌发前测72 h 的种子吸水率。 种子吸水值的测定方法是先称量种子干重，然后每隔5 ～7 h 测1 次种子湿重， 以湿重减去干重之差再除以湿重得吸水值。 对照培养皿中发芽率为100%时记录不同浓度梯度培养皿中的发芽率。 按国家种子质量检验标准， 水稻的发芽势分别于处理后3 天和4 天测定， 发芽率则分别于处理后7 天和10 天统计。 第8 天测量水稻的根长和芽长， 以30 株的平均值表示。 按发芽指数=∑Gt/Dt(Gt 为t 时间内的发芽数， Dt 为相应的发芽天数)， 活力指数=发芽指数×苗长度来计算发芽指数和活力指数(郑光华， 1986)。

水稻种子开始萌发时， 每天定时观察， 连续观察6 天记录其发芽数。 胚芽长至种子大小一半时就可认为已萌发。 至蒸馏水对照组种子的发芽数不再变化， 统计各组的发芽数， 以其百分比表示发芽率和发芽势。 实验终止时计算平均根长和根长的抑制率， 种子萌发6 天后， 测量所有水稻的最长根长， 求平均根长； 各组平均根长分别除以对照组的平均根长， 后与100%相减的结果即根长抑制率。 用刀片将所有的幼苗根剪下， 用电子分析天平测其质量， 即30 株根的生物量； 水稻种子胚到苗端的长度为芽长， 分别测量每组已萌发种子的芽长， 并计算每组芽长的平均值。

实验终止时测量叶绿素含量： 采用80%丙酮浸提法(苏正淑， 1985)。 测定步骤：(www.xing528.com)

(1) 芽长测量完后在避光条件下将幼叶剪碎、 混匀， 称取鲜重。

(2) 样品置研钵中， 加入少量碳酸镁和石英砂， 加入4 倍体积的80%丙酮研成匀浆， 再加85%的丙酮适量， 继续研磨至组织呈白色。

(3) 经铺有滤纸的漏斗将匀浆液转入50 mL 容量， 用80%丙酮定容至50 mL。

(4) 以80%丙酮溶液作参比， 在663 nm、 645 nm 分别测样品液的A 值(应在0.2 ～0.8 范围内， 浓度过大应用80%的丙酮适当稀释)。

(5) 根据Mackinney 方程计算叶绿素含量。