发光细菌在太湖水质监测中的应用效果

发光细菌在正常的生理条件下能够发射可见光， 多数种类存在于海洋生境。研究较多的种属有寄生在线虫体内的发光异短杆菌(Photorhabdus luminescens)、 发光杆菌属(Photobacterium) 的鳆鱼发光杆菌(P.leiognathi)、 希瓦氏菌属(Shewanella) 的羽田希瓦氏菌 (Shewanella hanedai)、 弧菌属 (Vibrio) 的哈氏弧菌(V.harveyi)、 费氏弧菌(V.fischeri)。 费氏弧菌曾被命名为明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum) (Victor 等， 2001)。 我国学者自海洋中分离出东方弧菌(Vibrio orientalis) (王安平等， 1993)， 自青海湖湟鱼体表分离出淡水发光细菌青海弧菌(Vibrio qinghaiensis)， 其典型株为V.qinghaiensis sp.Q67 (朱文杰等， 1994)。传统的水体污染物化学测试分析费时费力， 并且各种化学物质相互之间可能发生拮抗、 协同或叠加效应， 不能直接判定水质的联合毒性。

发光细菌的发光强度受环境中有毒物质影响并有很好的毒性强度-剂量效应，能达到快速、 灵敏和经济的检测要求。 发光细菌毒性检测技术 (luminescent bacteria toxicity test， LBT) 常选用发光较强， 对人非致病的哈氏弧菌、 费氏弧菌进行有毒环境样品的测定， 以光电倍增管等装置放大检测其抑制程度， 判断综合毒性。 1998 年国际标准化组织颁布了LBT 的标准方法， 用于河水、 塘水、 底泥， 甚至空气的毒性评价(Victor 等， 2001)。 20 世纪80 年代， 美国Backman 公司研制成一种生物毒性测定仪， 商标名称MicrotoxR， 测试时使用复苏的明亮发光杆菌(Photobacterium Phosphoreum) 冻干粉， 灵敏度甚至超过鱼类96 h 急性毒性实验(Bulich A.A.， 1981)。 V.fischeri-LBT 实验数据重现性好、 变异系数小， 不同仪器间差异对结果基本无影响(Marinella 等， 2006)。 经过多年的发展， V.fischeri-LBT实验灵敏度已经高于其他生物分析方法(如硝化抑制实验、 酶抑制实验、 呼吸抑制实验、 ATP 发光分析等) (Shahid 等， 2006)。 MicrotoxR 通过测试15 ～30 min 内发光细菌的相对发光率， 线性回归求发光降低50%对应的毒物浓度， 记为EC50(15 min)， 并根据此值范围划分毒性等级。

国际上用得较多的V.fischeri-LBT 产品有美国的MicrotoxR Model 500 和DeltaTox Analyzer、 德国的ToxAlert 和LUMIStox 、 芬兰的BioToxTM 等测试系统。 国内有中科院南京土壤研究所研制的DXY2 型生物毒性测定仪和华东师范大学研制的RS9901 型生物毒性测定仪。 赵华清等(2000) 用明亮发光杆菌T3 暗变种T9171菌株的复光实验进行水体污染物基因毒性筛选， 14 种环境样品中检出2 种阳性样品， 7 种样品呈可疑。 明亮发光杆菌T3 暗变种回复突变实验与经典的Ames 实验结果有较好的相关性， 但对于部分毒物灵敏度较差。 Yousef 等(2002) 用V.fischeri测试多环芳烃短期、 长期毒性， 在15 min 短期测试后转入18 h 的长期测试， 观察其生长和发光特点， 结果表明对于急性毒性未知的水溶性低的有机物， 长期测试结果比短期测试结果更完整。 随着水体pH 和硬度的增加， 五氯酚钠对明亮发光杆菌的EC50 值增加(施玮等， 2004)。(www.xing528.com)

淡水发光菌青海弧菌Q67 检测金属毒物有较高的灵敏度， 对环境NaCl 浓度要求低， pH 耐受范围广。 高继军等(2003) 应用青海弧菌Q67 测试了铜锌、 铜汞、铜镉、 铜镍4 种重金属混合物的联合毒性。 发现铜锌混合表现为叠加作用； 铜汞、铜镉、 铜镍3 种混合物的联合毒性表现为拮抗作用。 刘保奇等(2006) 建立了微板发光测试技术体系， 测定了取代酚对Q67 的发光抑制毒性效应。 莫凌云等(2006) 基于多种取代酚化合物对淡水发光菌青海弧菌Q67 的联合毒性， 建立了一定浓度范围内的毒性预测模型。

随着LBT 技术的发展， 人们开始致力于新型发光菌如基因工程发光菌的开发，以及重要有毒金属、 化学物质的特异检测。 特异或半特异基因工程发光细菌、 全细胞光纤传感器技术等推动了能分析水环境多毒物的新型系统集成。 ManBock Gu等(2001) 已研制出多重特异发光分析用的微生物传感器， 能区分毒物类型， 进而鉴别出水环境中更多的毒物。 但是目前国外研发的能较全面分析毒物类型的发光细菌光纤传感器体积仍较大， 还不适合应用于野外。 便携式发光菌光纤传感器功能相对简单， 除能综合判定毒性外， 区分毒物种类较少(David 等， 2004)。 微生物传感器小型化的瓶颈是指示菌的存活问题(Joakim 等， 2006)， 指示菌一般要求低温冷藏。 Dejene A.等(2006) 将生物固定化技术加细菌冷冻干燥技术联合应用， 开展了不同温度下保存固定化重组发光菌的研究， 常温保存条件下10 天后，恢复活性后的发光强度值降低较大， 但是这方面值得继续研究。 随着各种持续供应新鲜发光细菌并能同时检测毒性大小的传感器诞生， 微型、 节省培养基的传感装置将适合野外发展应用。 多种微生物发光组合微孔盘， 借助高灵敏的CCD 相机分析， 有可能对毒物进行分类。 在毒物特异检测方面， 高通量方法依赖于数学模型的建立， 也有赖于更多种类的特异发光检测微生物被构建； 光电检测设备的发展和低廉的单细胞检测装置的研究， 会进一步促进其发展。