系统测试与验收-国家蛋白质科学研究（上海）设施的设计与研制

9.4.1　满足验收的系统技术性能状态（表9-1）

表9-1　分子影像系统的验收指标

*DNA折纸术（DNA origami）是一种DNA纳米技术，其原理是利用经过精心设计的许多短单链DNA与一条长达数千碱基的DNA链杂交，在杂交过程中短单链DNA帮助长DNA链折叠成预先设计的形状，故被形象地称为DNA折纸术。

（续表）

（续表）

9.4.2　系统测试

9.4.2.1　单分子影像分析模块

1.原子力显微镜

（1）扫描成像测试

测试指标和依据：

在有足够技术人员、样品可实现同步制备的条件下，同时实现自动化快速扫描。扫描一个样品并得到稳定、高质量的图像，约需不到20 min。原子力显微镜可以测试每种类型的样品5个／d，可达到（8 h／d工作量）测量样品最大能力10个／d、每个样品3～5个图像的指标。AFM可对单个分子的表面进行三维成像，最高精度优于1 nm。

测试方法、测试设备及结果、测试结论：

①原子力显微镜检测293FT活细胞的表面三维形貌

a）实验方法

实验使用的AFM探针为硅针尖，弹性力常数为0.7 N／m（探针型号Bruker Scan Asyst-fluid+）。首先，在细胞房中用云母或玻璃片预先培养293FT活细胞，达到期望的理想检测密度。然后在成像检测之前，通过双面胶将云母或玻璃片固定在60 mm培养皿中。同时将PBS缓冲液温育至37℃，滴加到培养皿中，保持细胞存活和一直在缓冲液体系中。最后，通过光学显微镜初步定位以后，利用原子力显微镜智能扫描模式进行液相成像，用Scan Asyst-fluid+检测293FT活细胞的表面三维形貌。

b）测试设备及结果

测试设备为原子力显微镜。测试结果见图9-6。

图9-6　实时检测293FT活细胞的表面三维形貌（详见下载图9-6，下载网址见31页脚注）

height：高度；peak force error：峰值力误差；quadrature：正交幅值；inphase：同相位。

c）测试结论

AFM可以对单个细胞表面进行三维成像，最高精度优于1 nm。AFM扫描一个293FT活细胞样品，预先需要样品固定、温育、体系平衡，平均耗时10 min以上。扫描得到稳定高质量图像的整个过程，约需不到40 min，平均一个样品30 min。另外，补偿每次更换样品、系统参数调节、稳定实验体系或同一样品重复收集图像的时间约为10～20 min／次。正常情况下，原子力显微镜可以测试该种样品的最大能力为10个样品／d。

②原子力显微镜检测基于DNA折纸术的正三角形和矩形二维纳米器件之形貌

a）实验方法

实验使用AFM的探针为硅针尖，弹性力常数为0.4 N／m（探针型号Bruker Scan Asyst-air）或0.7 N／m（Bruker Scan Asyst-fluid）。首先，利用M13mp18病毒单链作为脚手架链，并利用经过Autodesk Maya 2012、Python 2.7.2、caDNAno 2.2.0、Can Do等程序预先设计好的很多带有修饰的订书钉链，按照特定比例在1×TAE-Mg2+缓冲液体系^[3]中混合以后，经过PCR退火处理，完成DNA自组装的折纸过程。然后，吸取预处理结束的样品2～5μl，滴加到新解离的新鲜云母表面。吸附几分钟以后，利用原子力显微镜轻敲模式、接触模式、智能扫描模式进行成像，同步检测基于这种DNA折纸术的正三角形和矩形二维纳米器件之形貌。

b）测试设备及结果

测试设备为原子力显微镜。测试结果见图9-7。

图9-7　基于DNA折纸术的正三角形和矩形二维纳米器件之形貌（详见下载图9-7，下载网址见31页脚注）

c）测试结论

AFM可以对单个分子表面进行三维成像，最高精度优于1 nm。AFM扫描一个DNA折纸术样品，并得到稳定和高质量的图像，约需不到20 min，平均一个样品15 min。另外，补偿每次更换样品、系统参数调节、稳定实验体系或同一样品重复收集图像的时间，约为5～10 min／次。在正常情况下，原子力显微镜测试该种样品的最大能力为20个／d。

③原子力显微镜液相检测在磷脂双分子层膜上的膜联蛋白A5单体的清晰二维结构

a）实验方法

实验使用的AFM探针为硅针尖，弹性力常数为0.7 N／m（探针型号Bruker Scan Asyst-fluid+）。首先，将磷脂双分子层膜制备在新解离的新鲜云母表面，约需30 min。然后，将预先准备好的0.1 mg／ml膜联蛋白（annexin）A5混合在含有2 mmol／L Ca2+的溶液中，滴加到细胞质膜上大约30 min。利用原子力显微镜的智能扫描模式Scan Asyst进行检测，对膜联蛋白A5野生型在磷脂双分子层膜上形成的三聚体结构以及膜联蛋白A5单体的清晰二维结构进行扫描成像。

b）测试设备及结果

测试设备为原子力显微镜，测试结果见图9 8。

图9-8　膜联蛋白A5在含有2 mmol／L Ca2+溶液中与磷脂双分子层膜结合，膜联蛋白A5单体的二级结构清晰可见。

c）测试结论

AFM可对单个分子表面进行三维成像，最高精度优于1 nm。用AFM扫描一个膜联蛋白A5样品，并得到稳定和高质量的图像，约需不到20 min，平均每个样品15 min。另外，补偿每次更换样品、系统参数调节、稳定实验体系或同一样品重复收集图像的时间，约为5～10 min／次。在正常情况下，原子力显微镜测试该种样品的最大能力为20个／d。

④原子力显微镜检测桑蚕丝的表面微观形貌

a）实验方法

实验使用的AFM探针为硅针尖，弹性力常数为0.4 N／m（探针型号Bruker Scan Asyst-air）或0.7 N／m（Bruker Scan Asyst-fluid）。首先将桑蚕丝预处理后经过化学浸泡、溶解，添加特定的缓冲液，稀释到合适的浓度，持续滴加到新鲜解离的云母表面，为时大约10 min；然后利用原子力显微镜QNM^[4]扫描模式进行快速扫描，检测桑蚕丝的表面微观形貌。

b）测试设备及结果

测试设备为原子力显微镜。测试结果见图9-9。

c）测试结论

图9-9　原子力显微镜以QNM模式快速扫描检测桑蚕丝的表面微观形貌（彩图见图版第53页）

AFM可对单个分子表面进行三维成像，最高精度优于1 nm。AFM扫描一个桑蚕丝样品，并得到稳定高质量的图像，约需不到20 min，平均一个样品15 min。另外，补偿每次更换样品、系统参数调节、稳定实验体系或同一样品重复收集图像的时间，约为5～10 min／次。在正常情况下，原子力显微镜测试该种样品的最大能力为20个／d。

⑤原子力显微镜检测阿尔茨海默病的疾病相关蛋白GAV-9短肽小分子在无机衬底上的一维外延生长的动态过程

a）实验方法

GAV-9肽（NH 2-VGGAVVAGV-CONH 2）是一个与几种神经退行性疾病相关蛋白质同源的保守序列。实验主要利用原位AFM，实时观察GAV-9肽在云母无机衬底上一维外延生长的动态自组装过程。

实验使用的AFM探针为氮化硅（Si3 N4）针尖，是弹性力常数为0.34 N／m（Bruker SNL 10）的A位置探针。首先将预先合成好的GAV-9多肽粉末用10 mmol／L磷酸缓冲液溶解，并稀释到合适的浓度，滴加一滴约30μl的磷酸缓冲溶液到新解离的新鲜云母表面。使原子力显微镜在轻敲模式下工作，在获得稳定成像后，使用探针旋滴法引入GAV-9溶液，到预定浓度。实验环境湿度控制在70%以上，温度保持在22±1℃。在所有的AFM实验过程中，尽量保持针尖与样品之间的作用力为一个最小值。然后，利用原子力显微镜，实时原位观察GAV-9短肽分子在云母无机衬底上一维外延生长的动态自组装过程，进一步了解和检测多肽分子在衬底表面的动态自组装过程，以及多肽和疾病相关蛋白质在体内的折叠与积聚机制。

b）测试设备及结果

测试设备为原子力显微镜。测试结果见图9-10。

图9-10　GAV-9短肽小分子在无机衬底上的一维外延生长动态过程

通过设计正确的多肽序列，调控多肽与衬底之间的相互作用力，可以达到控制多肽在衬底表面按照指定方式进行自组装，并进一步制造功能性纳米结构的目的。纳米结构的形成，在本质上是一个结晶的过程。通常认为，结晶过程涉及2个基本步骤——成核与生长。当调节GAV-9短肽达到合适浓度的时候，云母表面形成一些纤维细丝。原位观察发现，纤维细丝以末端为“种子”，可以继续延伸生长，这对今后实验具有很大的借鉴意义。通过进一步调节多肽的浓度，或许可以观察到更精密的生长过程，并为进一步研究按照人们意愿操纵和构造图案提供了可能性。在实验测试过程中，AFM设备运行稳定，最高精度优于1 nm，同时位移测量精度优于1 nm。即使在扫描速度较大的情况下，也能够得到较好的图像，为该课题在下一阶段的实验研究，提供了很大帮助。

c）测试结论

用AFM可以对单个分子表面进行三维成像，最高精度优于1 nm。用AFM可以对单个分子进行操纵，同时检测分子的位移（或形变）和力，位移测量精度优于1 nm。用AFM实时原位检测GAV-9短肽分子在云母无机衬底上一维外延生长的动态自组装过程，并进行稳定、高质量的扫描成像，整个过程约需不到60 min，平均一个样品50 min。在正常情况下，原子力显微镜测试该种样品的最大能力为10个／d。

（2）动力学测试

测试指标依据：

在有足够技术人员，样品可以实现同步制备的情况下，同时也满足标准化实验条件时，测量标准化样品得到100个以上的同一样品动力学测量结果，约需不到60 min。原子力显微镜可以一天测试每种类型的样品7～8个，可达到每天（8 h工作量）测量样品的最大能力为10个的动力学测试指标。

AFM可对单个分子进行操纵，同时检测分子的位移（或形变）和力，位移测量精度优于1 nm，力的测量精度范围为几十到几百皮牛（p N）。

测试方法、测试设备及结果、测试结论：

课题是用原子力显微镜检测人CD3胞内段多肽与细胞质膜内侧的相互作用力。

a）实验方法

实验中使用的AFM探针为Si3 N 4针尖，是弹性力常数为0.06 N／m（Bruker SNL 10）的D位置探针。首先利用PEG链接分子^[5]相关基团-NHS与探针表面的—NH 2进行化学反应，对NHS-PEG2000-MAL进行单分子修饰，连接到探针表面。随后利用PEG链接分子另一端的—MAL基团与巯基—SH进行化学反应，对预先表达纯化的C端带有半胱氨酸的人CD3胞内段多肽进行单分子修饰，连接到PEG链接上，从而得以将目标多肽偶联到探针上，在缓冲液中保存待测。同时，在经100μg／ml的多聚赖氨酸预处理的新解离的新鲜云母表面，培养293FT细胞；随后用特殊剥离法和100μg／ml K蛋白酶（proteinase K）处理细胞质膜表面残存的蛋白质，用R18等磷脂染料染色，从而标记获得293FT细胞内膜样品。用原子力显微镜以QNM扫描模式，在液相下预先扫描经过预处理的衬底表面形貌。经过初步定位以后，更换预先修饰好多肽的探针，校准探针的力学参数，在液相模式下搜索扫描面积大而且平整、经过预处理的衬底表面形貌后，打开自动坐标和定点位移窗口，选择快速力曲线工作模式，在多个定点选择和设定程序栏填写100（即为每个点测100条力曲线）。接下来在成像扫描模式中选择力曲线开始（Ramp Start）按钮，在扫描的图像中点击感兴趣的位置（ROI）。软件自动操作探针在感兴趣的点上反复抬压100次，在接触-离开（Approach-Retract）样品的循环过程中检测多肽与内膜之间的作用力，存储数据图像以供随后的分析。定量解析人CD3胞内段多肽与细胞质膜内侧之间的相互作用力。

b）测试设备及结果

测试设备为原子力显微镜，测试结果见图9-11。

通过新方法的样品准备，可以制得密度高、连续完整、表面较为平整的293FT细胞内膜。通过对大于2 000个相互作用力的力谱分析，最终约有500个力曲线的单分子统计结果显示：人CD3的胞内段多肽与细胞质膜内侧之间存在着较强的特异性相互作用力，大约几十到几百皮牛。突变体多肽N端的碱性氨基酸发生突变后，与野生型相比，相互作用力有明显降低，但是依然保持在较高水平，提示疏水相互作用也可能在其中同时发挥重要作用。

c）测试结论

用AFM可对单个分子进行操纵，同时检测分子的位移（或形变）和力，位移测量精度优于1 nm，力的测量精度范围为几十到几百皮牛。AFM实时检测一次生物分子（人CD3胞内段多肽与细胞质膜内侧）的相互作用力以及杨氏模量、力学性能定性、定量测试，整个过程约需不到60 min，平均一个样品50 min。在正常情况下，原子力显微镜测试该种样品的最大能力为10个／d。

2.高精度激光双光镊(www.xing528.com)

测试指标和依据：

图9-11　人CD3胞内段多肽与细胞质膜内侧的相互作用力（彩图见图版第54页）

height sensor：高度传感器；count：计数；bare tip：秃尖；force：力；force frequency：力频率；unpaired two-tailed t test：不配对双尾t检验。

最高精度优于1 nm。可对单个分子进行操纵，同时检测分子的位移（或形变）和力，位移的测量精度优于1 nm。力的测量量程宽于0.05～200 p N，精度为50 f N。

测试方法：

高精度激光光镊通过偏振分束，将激光分成2束。其中一束为固定光束，另一束通过压电陶瓷控制转镜实现微小偏转，进而精细控制双光镊之间的相对距离，其基本原理见图9-12和图9-13。高精度激光双光镊，能够精细捕获和操控微纳米尺度的微球，常被生化领域的研究者用来研究单分子的折叠动力学过程，如抗血凝蛋白的折叠和错误折叠、神经元SNARE蛋白复合物的单分子折叠动力学、RNA的折叠动力学以及微小力诱导的构象变化等。在这些单分子折叠动力学过程的测量中，常用微米级粒子如聚苯乙烯微球，作为力和位移的探针。通过地高辛-抗地高辛、生物素链霉亲和素（streptavidin）等的连接，可以将所要研究的单分子体系偶联到2个聚苯乙烯微球上。这样，通过高精度激光双光镊，就可以实时动态地测量单个分子的伸长量与受力；同时可以通过激光双光镊，对单分子加载一定大小的力，并能够精细改变力的大小，进一步研究在不同力的诱导下，单分子的折叠动力学过程。在这些单分子测量体系中，首先须标定光镊的精度以及测试单分子的能力。为此，采用高精度激光双光镊，捕获半径为1μm的聚苯乙烯微球探针，测量微球在光阱中进行受限布朗运动时的噪声功率谱，通过洛伦兹线型拟合，可以获得包括探测器响应、光阱刚度、光镊噪声水平等的光镊探测精度信息。

图9-12　聚焦激光形成梯度力的示意图

图9-13　光镊对粒子的作用力示意图

测试设备及结果：

高精度激光双光镊的光路如图9-14，其中捕获激光采用1 064 nm的近红外激光器，输出功率可达4 W。经磁光隔离和功率调整系统后，由望远镜系统T1扩束。再由偏振分束系统分成2束激光，其中一束由压电转镜微调角度，实现2个光镊之间的相对运动。经角度调整后，望远镜系统T2将转镜共轭到捕获物镜O1的后焦面。2束光经搜集物镜O2以及后续光路系统，分成2束，分别被2个位置传感探测器所探测。照明光采用LED科勒照明系统，由CCD对捕获的微球进行实时成像。

图9-14　激光双光镊光路图

LED：发光二极管；PM：偏光片；HWP2：半波片2；PSD：位置灵敏探测器；BB：挡光元件；ISO：隔离器；CCD：相机系统。

①激光器：采用光谱物理公司生产的近红外激光器，型号为CW，ND：YVO4（1 064 nm）。半导体泵的激光，最大输出功率可达4 W，最大实际测量功率可达5.3 W。定制带10 m光纤，输出波长为1 064 nm，模式为基模的激光器。

②显微镜物镜：采用奥林巴斯（Olympus），60×水浸，在1 064 nm波长处的透过率达到80%。

③位置敏感探测器：采用DL100-7 PEBA3型位置敏感探测器，对位置进行测量。经过数据采集卡，采集并记录到计算机。

④纳米转台：采用MadCity Lab公司的双轴铝制纳米转台系统（nano-MTA2X，aluminum），偏转范围为0～5 mrad，控制精度可达10 nrad。

⑤样品池控制系统：采用Newport公司的ESP301三轴控制器，控制3台电机，以及3个电机控制样品池的三维移动。电机的移动范围为0～12 mm。可采用操作手柄，方便地移动样品池位置。

⑥数据采集和控制卡：采用美国国家仪器公司的PCI-6289，M系列采集卡。它具有32路模拟输入、48位数字输入／输出、4路模拟输出，具有18 B（比特）解析度。采集卡的指标为：单通道能达到625 kS／s，多通道能达到500 k S／s。

⑦显微成像系统：图像数据采集卡采用Basler sc A640-74fc型相机，图像分辨率为658×492像素，最大采集速率为74帧／s。相机采用1 394 B线与图像采集卡相连。

⑧防振台：台面尺寸（长×宽×高）为4英尺×6英尺×18英寸^[6]，型号为TMC 784 751-02R。隔振腿均为独立设计，型号为14M-144-00。采用SV-14型平台气阀。

⑨工业控制计算机：采用戴尔（Dell）公司的T3600工作站，处理器为E5-1650。具有支持显微成像器件、激光器控制、数据采集卡以及转镜等硬件设备的接口，能够对数据进行实时采集和记录。显卡具有支持四屏输出的功能，其中2台显示器放在控制室，第三台显示器放在仪器间。

⑩激光切割机：采用美国Epilog生产的Zing 16激光切割系统。型号为Zing16-30W CO2激光器，最大切割尺寸为406 mm×304 mm。

高精度激光双光镊捕获2个聚苯乙烯微球的实时实验影像，如图9-15和图9-16所示。其中2个聚苯乙烯微球的直径约为2μm。

图9-17为处在光阱中的聚苯乙烯微球作受限布朗运动位移时的功率谱（红色曲线）。作为对照，蓝色曲线为光阱中没有微球时测得的激光光斑重心位置的功率谱，紫色曲线为激光关闭时测量得到的探测器的本地噪声功率谱。

激光光镊的光阱阱域约为被捕获微球的半径。对于实验所采用1μm半径的聚苯乙烯微球，由激光光镊捕获聚苯乙烯微球运动位置的功率谱，可以进一步拟合得出。位置敏感探测器的电压位移转换系数为1～2 m V／nm。在激光器输入为1.5 W时，光阱刚度的典型值约为0.2 p N／nm，因此光阱的最大阱力可估算为1μm×0.2 p N／nm＝200 p N，光阱的测力范围可以通过增大激光功率而适当加大。本系统激光双光镊的最大功率可达5 W。功率谱的进一步分析表明，光镊位移探测精度约为0.08 nm／Hz1／2，力的探测精度为0.08 nm／Hz1／2×0.2 p N／nm＝16 f N／Hz1／2，优于50 f N的设计指标。

图9-15　高精度激光双光镊示意图（详见下载图9-15，下载网址见31页脚注）

图9-16　双光镊捕获2个聚苯乙烯微球示意图（彩图见图版第54页）

图9-17　光阱中的功率谱比较（彩图见图版第55页）

进一步，可以直接测量位移和力的功率谱，由功率谱估算探测噪声的水平，以衡量光镊的探测精度，如图9-18所示。

从图9-18可以估算，位移探测精度约为0.07 nm／Hz1／2，力的探测精度为25 f N／Hz1／2，均优于设计指标。

在标准化实验条件下，在对单分子用品浓度和实验条件已经优化的前提下，考虑DNA微球的偶联，以及实验准备大约需要1～2 h，实际测量时间按照5 h／d计算，在一般蛋白质折叠动力学过程的测量中，每个态的寿命在毫秒量级，采集15 min数据足以解析蛋白质动态过程，因此检测样品的能力可优于20个／d。

图9-18　位移（a）和力（b）的功率谱

测试结论：

高精度激光双光镊采用偏振分束，采用压电转镜来精细控制光阱的相对距离，可以对单个分子进行操纵，并检测分子的伸长和受力，位移的测量精度优于1 nm，力的测量量程宽于0.05～200 p N，精度优于50 f N。可检测单分子样品20个／d，符合预期的设计指标。

9.4.2.2　小动物影像分析模块

1.小动物化学发光荧光成像设备检测能力测试

（1）验收指标：每天能对100个样品进行检测。

（2）测试方法：将荧光素注入小鼠皮下。受试小鼠150只。3人进行实验，1人负责麻醉，1人负责设备操作，1人负责小鼠操作。留下1组小鼠，观察几天，看细胞的扩散程度。

（3）测试结果：对小鼠脂肪垫注射标记过的肿瘤细胞，3周后进行成像检测（腹腔注射荧光素酶底物），结果如图9-19所示。

对信号区域进行信号强度测算，得到图9-20的结果。

继续饲养至4周，再次进行上述检测，得到结果如图9-21。

对信号区域进行信号强度测算，得到图9-22的结果。

可以观察到，随着饲养时间的延长（3～4周），信号强度增加。因为信号强度与标记的细胞数量呈线性关系，故可以得出结论：标记的细胞数量增加。

（4）测试数量：每次测试5只，每次大约20 min。上午8:30—12:00，测试10次，合计测试50只小鼠；下午13:00—17:00，测试11次，合计测试55只小鼠。全天合计测试105只小鼠。

图9-19　对小鼠注射肿瘤细胞3周后的成像检测成果（彩图见图版第55页）Image：图像；Color Bar：对比度；Min：最小；Max：最大。

图9-20　小鼠影像分析测试中注射3周后对信号强度的测算结果（彩图见图版第56页）

图9-21　对小鼠注射肿瘤细胞4周后的成像检测结果（彩图见图版第56页）

图9-22　小鼠影像分析测试中注射4周后对信号强度的测试结果（彩图见图版第57页）

图9-23　X射线辐照仪

（5）测试结论：此设备性能完好，工作正常，完全达到测试指标要求。

2.X射线辐照仪的设备测试

（1）验收指标：每天对50个样品进行检测。

（2）测试方法：小鼠X射线照射（见图9-23），每次每笼5只小鼠，每次15 min左右。把小鼠放置于辐照室内，关上门进行开机辐照，上午8:30—11:30，测试9次，每次5只小鼠，合计45只小鼠；下午13:30—16:30，测试10次，每次5只小鼠，合计50只小鼠。一共测试95只小鼠。

（3）测试结论：此设备性能完好，工作正常，完全达到测试指标要求。

3.样品制备测试

饲养设备已经到位，实际计算结果是，IVC笼位3 072笼，屏障开架笼位（见图9-24和图9-25）4 600笼，大鼠笼位310笼。合计小鼠笼7 672笼，大鼠笼310笼。满足设计指标。

图9-24　IVC（小鼠独立通风笼具）

图9-25　大鼠及小鼠的平板架饲养模式

9.4.3　系统验收

通过对上海设施的分子影像系统各项指标的测试以及分析，可以得出结论：本系统满足452—453页“9.3.3 系统研究计划”中提出的各项具体技术指标。