国家蛋白质科学研究设施的系统设计方案

9.2.1　系统建设目标、技术方案和性能指标

9.2.1.1　系统建设目标

系统计划建立的模块包括单分子影像分析模块、活体小动物分子影像模块以及配套的样品模块，含实验动物房等设施。

9.2.1.2　系统技术方案

分子影像系统中的2个模块具有相对独立性，也可以有机地进行组合，相互印证，综合研究蛋白质在生命活动中的功能。具体技术方案见图9-1。

图9-1　分子影像系统技术方案图

9.2.1.3 系统性能指标及验收说明

（1）单分子影像分析模块：可对单个分子或者细胞表面进行三维成像，最高精度优于1 nm。利用倒置显微镜实现荧光图像同步测量。可对单个分子进行定位操纵，精度优于1 nm，同时检测分子的位移（或形变）和力。位移的测量精度优于1 nm，力的测量量程宽于0.05～100 p N（皮牛顿），精度50 f N（飞牛顿）。可实现时间分辨显微、荧光寿命成像、单分子光谱等功能。在标准化实验条件下，原子力显微镜、光／磁镊动态检测、单分子荧光技术可分别测量样品20个／d。本模块可测量样品60个／d（包括可对20个蛋白质样品进行动力学检测）。

（2）活体小动物分子影像模块：可对活体小动物样品，利用化学发光、荧光、X射线及超声波，提供三维成像功能。最高空间分辨率优于10μm，时间分辨率接近实时。在标准化实验条件下，应用化学发光／荧光、X射线（micro-CT，微计算机断层扫描技术）及超声技术，每天可分别对100、50、100只小动物进行检测。本模块总共可检测小动物200只／d。

（3）样品模块（实验动物房）：饲养模式为屏障系统，部分（25%）加独立通风笼盒（independent ventilation cage，IVC）。最大饲养容量：小鼠5 000只左右，大鼠2 500只左右。

在性能指标中的“标准化实验条件”，是指国际同行公认的标准化实验样品及已经过优化的、切实可行的实验条件和步骤。只有在标准化实验条件下，才能确定1台仪器每天测量样品的最大能力。

9.2.2　系统构成与可行性研究设计

9.2.2.1　系统构成

分子影像系统是开展蛋白质科学相关的分子影像动态示踪研究之必备基础设施。本系统的独特之处在于，将成像的分辨率提升到纳米尺度的单分子水平，以及可对活体小动物的分子影像进行实时观测。本系统将从多层次、多尺度上，全面支持蛋白质分子结构与生理功能的研究，建立单分子影像分析、活体小动物分子影像实验的模块，以及配套的样品模块，包括实验动物房等。

1.单分子影像分析模块

单分子影像分析模块，以原子力-荧光倒置显微镜系统、高精度激光双光镊动态检测系统和超高分辨率单分子荧光检测仪器设备为支撑，并匹配相应的数据处理配套设备，以多种检测手段与方式，对单个细胞或单个生物大分子进行形貌特征、生化特征的相互印证与补充检测。

（1）原子力显微镜

原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）的基本原理是：将一个对微弱力极敏感的微悬臂的一端固定，另一端有一微小的探针，针尖与样品表面轻轻接触。由于针尖尖端原子与样品表面原子之间，存在极微弱的排斥力，通过在扫描时控制这种力的恒定，带有针尖的微悬臂即对垂直于样品的表面方向发生起伏运动[9]。利用光学检测法，可测得微悬臂对应于扫描各点之位置变化，从而可以获得样品表面形貌的信息。原子力显微镜的横向及纵向（即x、y方向）上的测量精度可达到1 nm，与扫描电子显微镜相当；而纵向（即z方向）上的精度则达到0.2 nm，高于电镜的分辨率。相对于电镜，原子力显微镜还具有提供样品的三维表面图像，不需要对样品进行特殊处理，可在常压下及液体环境下良好工作等特点，故可以用来研究蛋白质的表面三维结构及蛋白质复合物的结构。另外，为配合当今蓬勃发展的生命科学研究领域的需要，原子力显微成像也进入活细胞领域。新的生物型原子力显微镜系统，能够与多种商用倒置光学显微镜配合使用，在观测细胞光学或荧光图像的同时，进行纵向／横向大尺度的细胞表面成像[12]。这项新技术的诞生，开辟了一些全新的研究方向，例如在细胞上以超高分辨率标定膜蛋白的结构与活性等[13，14]。

本系统引进一套高端原子力显微镜与倒置显微镜的整合系统，以满足设施在蛋白质单分子和细胞成像方面的需要。原子力显微镜配备2台扫描器，即分子型和生物型扫描器；并选取小巧稳定、易于操作的型号，以适应生物学研究的需要。购置2套控制器，以便使2台扫描器可以同时工作。

分子型扫描器也称为扫描探针显微镜，用于超高分辨率、高稳定性及快速单分子成像。其主要技术性能指标如下。

①扫描范围：≥10μm×10μm×2.5μm。

②系统噪声水平：＜0.03 nm。

③传感器噪声水平（闭环扫描头）：＜1 nm（x Y），＜0.1 nm（Z）。

④x Y轴热漂移水平：＜50 nm／℃。

⑤分辨率：可以持续稳定地对云母或石墨样品得到原子级分辨率。

⑥扫描速度：对硅片10μm扫描范围的扫描速率＞10 Hz，而图像不失真。

⑦数据通道：实时≥8通道。

⑧最大解析度：≥5 120×5 120像素。

⑨力测量精度：实现10 p N以下的力测量。

生物型扫描器主要侧重于对生物样品特别是活细胞，进行高精度三维表面成像，跟与倒置显微镜相结合的光学测量如相差、荧光、全内反射荧光等同步进行。其主要指标如下。

①扫描器范围：x Y轴＞90μm、Z轴＞15μm。

②系统噪声水平：＜0.1 nm。

③传感器噪声水平（闭环扫描头）：＜1 nm（x Y），＜0.1 nm（Z）。

④最大解析度：≥5 000×5 000像素。

⑤成像温度范围：室温至80℃，工作范围±0.1℃的稳定度。

⑥可结合多种光学技术，如明视场、相位、表面荧光、TIRF等。

高分辨率地扫描一个蛋白质或细胞样品，约需30 min。考虑到准备及校准仪器的时间，分子型和细胞型原子力显微系统能测量样品20个／d。

（2）高精度激光双光镊

分子影像系统的高精度双光镊系统，主要用于研究蛋白质等的折叠、去折叠以及分子间相互作用等生物大分子的力学特性，力学测量范围在0.1～200 p N，时间测量精度＜1 ms，进而揭示分子微观过程的动力学机理，可操控和追踪微米介质小球，并测量记录2个颗粒间的作用力与运动状态等信息（图9-2）[15]。

图9-2　高精度激光双光镊

2.样品模块

本模块由2部分组成——样品制备设备和实验动物房。

（1）样品制备设备：包括常用的动物解剖设备、组织切片设备、胚胎融合设备、细胞培养设备，以及制备动物及单分子实验样品所必须用到的生物安全柜、超净工作台、低速离心机、天平、pH计、冰箱、离心机、制冰机、移液器、液氮罐、水浴锅、PCR仪、等离子臭氧清洗机和惰性气体操作箱等。其他较大规模的蛋白质制备和细胞培养工作，将利用其他子系统已有的设备进行，而无须重复购置。由于在本系统中，活体小动物分子影像模块的主要研究对象是小鼠或者其他小动物，它们对周围环境的影响很敏感，而且实验过程必须尽可能在短时间内完成，因此动物房和生物样品准备实验室须在分子成像实验装置的附近建立，以减少从饲养间到实验装置之间运输所带来的不必要影响。屏障环境是指动物生活在气密性很好的设施环境内，设施内外的空气交流只能通过由特定通道进入与排出的空气净化单元。屏障环境用来饲养实验动物。一切进入屏障的人、动物、饲料、水、空气、铺垫物、各种用品，均须经过严格的微生物控制。进入的空气须过滤，过滤按屏障环境防止污染的要求不同而略有差别。屏障环境内通常设有供清洁物品和已使用物品流通的清洁走廊与污物走廊。空气、人、物品、动物的走向，采用单向流通路线。利用空调送风系统，形成清洁走廊→动物房→污物走廊→室外的静压差梯度，以防止空气逆向形成的污染。屏障内的人和动物尽量减少直接接触。工作人员要走专门通道，工作时应戴消毒手套，穿着灭菌工作服等防护用品。

独立通风笼（IVC）是一种气密性好，并伴有净化和机械通风的特殊笼具。它在国外被应用大约有10年，中国近年来开始推广使用。目前国内主要用它饲养无特定病原体动物级的实验大鼠及小鼠。

（2）实验动物房：由屏障系统、各级（清洁级、SPF^[1]级、无菌级）实验动物饲养间、样品准备实验室、物料传递及消毒设备、温湿度控制系统、进排风机、IVC系统、生物安全柜、低温高速冷冻离心机、监控系统等组成。动物房按照国际上基本的设计施工规范自主建造，同时购置温湿度控制系统、进排风机、IVC系统等动物房的核心设备。

实验动物房的指标如下。

①饲养模式：屏障系统，部分（25%）加独立通风笼盒（IVC）。

②最大饲养容量：小鼠5 000只左右，大鼠2 500只左右。

③环境控制：高效过滤系统、屏障系统：10 000级；部分加IVC：优于10 000级。(www.xing528.com)

购置常用的动物生理检测、行为记录、解剖、组织切片以及胚胎实验操作系统。

9.2.2.2　可行性分析

分子影像系统除了高精度激光双光镊以外，单个技术设备基本全部实现了商品化，可从国内外公司购得。分子影像系统建设的关键内容是：将不同的设备和部件通过系统集成的方式进行整合，从而形成完整的研究装置系统。对于大型仪器，统一采用国际招标和技术综合评定，从现有的生产厂家订购。

9.2.3　系统仪器设备、器件与部件

在系统的硬件配备上，考虑到系统内各模块的相互关系和内在平衡，合理及高效地分配及使用资金，进行关键设备技术的研发与自主创新，优化各相关设备的科学组合，同时还考虑到仪器设备正常检修和维护期间的系统运行需求。系统投资为2 770万元。分子影像系统按照模块、设备和部件分别设计如下。

9.2.3.1　单分子影像分析模块

单分子技术是在微观尺度上，用先进的物理、化学等纳米科技手段，观测示踪单个分子的新技术方法。单分子技术能够提供传统宏观实验方法所无法提供的单个分子在微环境中的个体信息，从而避免传统测量方法带来的整体平均效应。本模块紧扣当今的新技术热点，引进常用的单分子实验手段——原子力显微镜、光镊以及单分子荧光检测技术。这些技术各有所长，相互补充，使得本模块构成一个功能强大的单分子纳米技术平台。其中，原子力显微镜的特点是精确到纳米级的分子表面成像，光镊侧重于生物单分子的精确三维操纵及微小力学量和动态结构的检测，单分子荧光技术则可用于观测示踪多个单分子在微环境中的动态行为。

原子力显微镜能够在大气以及液体环境中，快速并准确地观测样品表面微观（纳米及亚微米尺度）的三维形貌，同时可对样品表面的物理化学特性进行研究；能够测试多种样品表面的高分辨结构，如生物分子、活细胞、蛋白质等样品的纳米结构及快速变化的过程，可以直接在大气或液体中得到高分辨的图像及力学信息[16]。

单分子影像分析模块实时原位表征以及实时动态分析蛋白质在生物体中的活动；支持从单分子、单细胞到组织、器官、活体动物的多尺度、多层次研究；全面支持蛋白质分子动态性质与生理功能的研究，从而极大提升上海设施两个方面的能力，即多尺度结构分析和多层次动态研究的能力。

1.原子力显微镜Dimension Icon/FastScan AFM性能特点

①它是最高性能的针尖扫描方式的扫描探针显微镜（图9-3），带210 mm直径的真空吸附，以及全自动样品台、多样品支持样品台。

图9-3　Dimension Icon／FastScan AFM快速扫描原子力显微镜

②FastScan快速扫描原子力显微镜扫描器，在轻敲模式（trapping mode）下扫描器成像速度可以快20倍。

③Icon x YZ三轴闭环扫描器，x Y方向为90μm，Z方向＞10μm。

④快速扫描三轴闭环扫描器，x Y方向35μm，Z方向＞3μm。

⑤Z方向噪声水平：开环控制＜0.03 nm；闭环控制＜0.035 nm（图像测试），＜0.05 nm（力测试）。

⑥x Y方向定位噪声水平：开环控制＜0.10 nm，闭环控制＜0.15 nm。

⑦定量表面机械性能测试：不仅可以对样品表面形貌进行高分辨率成像，同时可以对纳米机械性能（包括弹性模量和黏附力）成像。模量1 MPa～70 GPa，黏附力10 p N～10μN。

⑧整体封闭一体式防振台。

⑨基本功能特点：接触模式（contact mode）、轻敲模式（tapping mode）、智能扫描模式（scanasyst mode）、峰值力轻敲模式（peak force tapping）、快速力曲线及力谱线（picoforce）、抬高模式（lift mode）、扭矩共振模式（TR-mode，tapping-TR）、高次谐波共振模式（harmonic mode）、液体环境的接触模式和轻敲模式、液体环境的智能扫描模式（Scan Asyst mode），相位成像模式（phase imaging mode）、倾向力／横向力显微镜（LFM）、静电力显微镜（EFM）、磁力显微镜（MFM）、表面电势／开尔文显微镜（KFM）^[2]等。

2.Bioscope Catalyst AFM性能特点

单分子影像分析系统的Bioscope Catalyst原子力显微镜（图9-4），实现了AFM与光学显微镜的完美结合与整体优化设计。它跟倒置荧光显微镜Olympus IX73完全兼容。Bioscope Catalyst AFM提供液体及大气环境中的接触模式、轻敲模式、智能扫描模式等功能特点的高分辨表面测试，并实现快速力曲线及力谱线测试，同时提供在空气中应用的探针支架Model Catalyst-ACH，以及液体环境探针支架Model Catalyst-FCH。

图9-4　Bioscope Catalyst AFM快速扫描原子力显微镜（彩图见图版第53页）

（1）Bioscope Catalyst压电陶瓷扫描台：x Y闭环控制达到150μm，开环状态可达到180μm。高精度马达的x Y样品移动台（移动范围12.5 mm×12.5 mm），精确控制样品与探针的相对位置。样品扫描的设计可实现与光学显微镜的最佳结合。标准的样品台可兼容高数值孔径的物镜，包括油镜等。

（2）Bioscope Catalyst扫描头的创新设计：提供具备独有光学兼容性并可达到Z方向＞16μm的扫描器，还有低噪声的闭环控制。悬臂梁的弯曲检测采用垂直850 nm的激光光路，有效提高力学测试的性能，并避免与荧光信号相互干扰。

（3）Bioscope Catalyst微量液体池：总体积小于60μl，可以实现快速换液。另外的培养皿液体组件的附件，可以实现培养皿液体测试。同时配有环境液体池，可将50 mm的玻璃培养皿或60 mm的塑料培养皿置于一个软性密封的体系，用来长时间地维持细胞或生物样品的生理活性，液体或气体都可以注入腔体中。可以结合其他控制液体流入的微流控制器、微量蠕动泵装置加以应用。

（4）Bioscope Catalyst温度控制附件和细胞培养环境附件：温度控制范围从室温到60℃，包括温度控制器及线缆、适用的载玻片（25 mm×75 mm）、盖玻片（25 mm×25 mm）、塑料培养皿（60和35 mm）、玻璃培养皿（50 mm）等。

（5）Bioscope MIRO软件：可以实现光学图像与原子力显微镜图像及数据的同步重叠分析：可输入及重叠多个光学及AFM的图象，可通过软件路径注册光学及AFM的图像选择，可在注册的光学图像上选择区域得到AFM图像及数据，优化参数，储存或重新储存不同体系的文件（如不同的镜头），调整图像颜色、透明度及重叠的选项——独立的图像通道，输出重叠数据组等。

3.高精度激光双光镊

分子影像系统的高精度双光镊系统，主要用于研究蛋白质等的折叠、去折叠以及分子间相互作用等生物大分子的力学特性，力学测量范围为0.1～200 p N，时间测量精度＜1 ms，进而揭示分子微观过程的动力学机理，可操控与追踪微米介质小球，并测量记录2个颗粒之间的作用力和运动状态等信息。光路设计见图9-5。

图9-5　高精度激光双光镊的光路设计图

9.2.3.2 样品模块

本模块由2部分组成——样品制备和实验动物房。

样品制备设备包括常用的动物解剖切片设备、细胞培养设备以及单分子实验样品制备所必须用到的设备等。实验动物房按照国际上基本的设计施工规范自主建造，同时购置温湿度控制系统、进排风机、IVC系统等动物房的核心设备。样品模块的重要性在于，不但为本模块提供分子、细胞及动物样品，还为设施的其他系统提供在体功能研究样品、实验动物以及必要的技术支撑。

样品制备模块包括单分子标准生化实验室，涵盖主要辅助设备和试剂耗材。

①紫外-臭氧清洗仪；

②等离子清洗仪；

③超声波加热清洗仪；

④惰性气体手套箱；

⑤粗天平、精天平、精密微量天平；

⑥生化培养箱；

⑦细胞培养箱；

⑧超低温冰箱；

⑨高速离心机；

⑩其他相关设备：电子防潮箱、超净工作台、磁力加热搅拌器、磁力搅拌子、通风橱、冰箱、小型离心机、台式离心机、冷冻离心机、真空干燥瓶、真空泵、真空干燥箱、探针／衬底修饰专用镊子、尖头镊子、弯头镊子、剪刀、手术刀、裁纸刀、电动助吸器、移液器、烧杯、量筒、恒温水浴、涡旋振荡器、pH计、制冰机等。

单分子影像分析模块的全部实验环境，具备独立的设备减振基础、安静的局部隔离环境、尽可能低的系统噪声。可以实现稳定可控的温度与湿度条件，拥有UPS电源、空气净化系统等。

活体小动物影像分析模块，以动物房设施为独立楼栋，总建筑面积近3 000 m2，其中1楼是辅助区和部分屏障区，2楼和3楼都是屏障环境。有近10 000个IVC小鼠笼位、300个大鼠笼位，可为国内外用户提供服务。