国家蛋白质科学研究（上海）设施设计与研制

8.3.1　设备到货前的条件保障

复合激光显微镜系统成像及流式设备，属于精密设备，价格昂贵，而且轻微的环境变化或操作失误，就会导致无法得到准确的实验数据。例如，超高分辨率显微镜Nikon NSTORM的x Y分辨率为20 nm，即使轻微的振动也会导致采集图像位移。因此在设备入场之前，须将设备配套的相关设施准备妥当。下面以双光子显微镜为例进行说明。

1.设备间面积与楼板承重

双光子显微镜Olympus FV1200MPE由一套双光子激光器支撑正置和倒置2台显微镜的使用。在防振台的选择上，须选择较大的减振台，以方便在此之上搭建光路与放置设备，因此重量也会较大。这里除了设备间的面积以外，还需要考虑设备间楼板每单位面积内的承重。防振台重：1 572 kg；设备间面积：45.5 m2；防振台覆盖面积：5.44 m2，底座面积4 m2；单位面积承重：443 kg／m2（含显微镜50 kg／m2）；现有楼板承重强度：500 kg／m2。结论：可行。

2.温度和湿度

温度的不稳定，会导致设备受热不均，发生轻微形变，从而影响实验的结果；尤其在活细胞成像时，焦面易因此发生漂移。较大的湿度会缩短光学元件的使用寿命。我国南方地区湿气较重，尤其在梅雨天，除湿是重中之重。工作温度：室内夏季22±1℃，冬季20±1℃；须安装辅助控温空调。相对湿度：40%～50%，须使用除湿机。

3.设备间最大用电量及布线布局

根据设备正常运行时对于用电量的需求，在设备间的建设中就要决定最大用电量，并根据不同设备的不同用电需求来进行布局。设备一般要配备不间断电源（UPS），以降低突然断电造成数据丢失或者设备损坏的可能性。最大用电量：16 A×3，另外常规10 A若干，独立接地；不间断电源配置：20 kVA。

4.CO2钢瓶

对于可以做活细胞实验的设备，均须配置CO 2钢瓶。CO 2钢瓶的选择有2种，一种是纯度≥99.995%的CO 2，另一种是5%CO 2+20%O 2+75%N 2。这里需要注意的是，与2种钢瓶配套的表头是不一样的。尤为重要的是，钢瓶须靠墙固定，防止振动引起钢瓶倾倒而造成爆炸。

5.地面振动

在5～30 Hz频率范围内，振幅＜30μm／s；在＞30 Hz范围内，振幅＜60μm／s。

6.防尘要求

普通清洁级。如有条件，可装至10万级或万级。流式分选及细胞房建议万级。

7.激光安全等级

4级，避免直视激光。

8.散热

6.2　kW，活细胞实验须在空调运行的情况下进行。

9.暗室

仪器间的整体为暗室，因设备配置有灵敏度极高的探测器。为防止操作电脑漏光并提高采图的信噪比，在显微镜上额外加黑色避光罩。

10.其他

有充分的、温和的新风换气系统。配备网络。有门禁系统。门宽1 m，方便设备安装时进入，有独立的缓冲间。

每台设备根据其性能和配置，都会对环境有特殊的要求。在设备入场前，要确保这些条件都能够满足；否则装机之后如发现有问题，将会极大地影响实验结果，乃至设备本身。

8.3.2　设备到货及安装注意事项

系统中的单个技术设备，均已实现了商品化。大型仪器统一采用国际招标和技术综合评定，从现有的生产厂家中调研择优订购。小型辅助设备依据实际情况，从国内外公司购得。将不同的设备和部件通过系统集成的方式进行整合，从而形成完整的研究装置系统。所有仪器设备（包括国内和国外）的包装和运输、安装和调试，列入采购合同中，由供应商负责提供，采购方负责验收是否符合要求。因此在设备到货安装及厂方调试期间，我方技术人员起到参与协调、监督、记录等作用，但是禁止接触设备。供应商安装到位，并且调试认为运行正常之后，由我方技术人员在厂方工程师在场的情况下，进行性能测试。测试通过后，方可通过设备验收。

8.3.2.1　设备到货

根据现场建筑安装情况、系统技术人员配备情况、仪器的特性及运输等因素，合理安排各台仪器的到货、安装、调试时间。提前通知相关部门人员，做好每个环节的准备工作。

①到货：考虑天气因素，避开大雨天气。

②卸货：参与人员明确卸货平台的位置、卸货后仪器存放的位置，以保证安全。

③验收：检查外包装情况，拍照，记录到货情况。并详细记录，把相关资料存档。

货物交接中如发现外包装有破损，由运输方出具破损单，以便与有关部门交涉；如果无法提供破损单，则拒收货物。如果发现没有按照规定方向放置等情况，则拍照记录，并向在场各方提前告知和备案。在无法确保设备不受损，性能无影响的情况下，拒收货物。

8.3.2.2 设备安装

①拆箱、搬运、安装实施人员：厂方工程师。

②安装条件落实：检查供电状态，包括容量、电压、电流、稳定情况等，注意电压是否与仪器安装的要求相符，例如转盘式激光共聚焦显微镜要求电压为380 V，流式细胞仪自带变压器。还要检查温度、湿度、振动等。

③安装：参与人员明确拆箱的位置、拆箱后仪器安装的位置，以保证安全。

④验收：系统技术人员检查拆箱情况，拍照，记录，清点，并详细存档。

8.3.3　设备调试

系统所提供的设备调试方案，由技术人员根据设备性能提出，用于测试设备是否可以达到厂家所承诺的设备功能标准。

成像设备虽然有很多种，但考察的方面主要有空间分辨率、时间分辨率、扫描深度、多维扫描／不同分析方法和应用等。因此，在常规试验样品、耗材及实验方法上有共同之处。下面将以单光子激光共聚焦显微镜为例，详细介绍耗材和方法。关于其他成像设备，则仅侧重介绍不同之处和结论数据，以突出不同成像设备应用的特长与特性。

具体调试方案如下。

8.3.3.1　双光子显微镜成像模块

共有4台大型设备，包括3台单光子激光共聚焦显微镜和1台双光子显微镜。

1.单光子激光共聚焦显微镜

有3台，型号为Leica TCS SP8（2台）和Zeiss LSM 710（1台），见图8-3。

图8-3　单光子共聚焦显微镜现场图

单光子激光共聚焦显微镜系统，是基于针孔共轭技术的显微成像系统。其特点是焦平面以外的点，不会在探测针孔处成像。这样得到的共聚焦图像，是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。Leica TCS SP8显微镜配备Leica DMI6000CS全自动倒置荧光显微镜、405 nm激光器和氩离子（Ar+）激光器、561 nm激光器和633 nm激光器、HyDTM高灵敏度探测器。Zeiss LSM710显微镜还配有活细胞培养装置、自动对焦系统、Big高灵敏度探测器。该模块可进行荧光多通道多层扫描、拼图扫描、时间序列成像、荧光漂白恢复（FRAP）、荧光共振能量转移（FRET）、光谱扫描等实验，可用于细胞及组织样品的微分干涉及荧光成像、细胞和亚细胞结构的定量分析、活细胞样品的长时间观察等。

在仪器调试阶段，应提前准备如下试验样品及耗材：

①标准尺度的荧光微球（直径200 nm四色荧光）；

②固定细胞样品（多荧光标记样品：DAPI／FITC／TRITC／CY5）^[2]；

③固定组织样品（染色或者荧光标记组织切片，如脑片）；

④玻璃底35 mm直径培养皿、CO2气体、培养装置；

⑤FRAP样片；

⑥CFP／YFP标记的FRET样片；

⑦荧光标记Ca2+的样品；

⑧镜油、擦镜纸、盖玻片、载玻片、无水乙醇、测试标准样片等。

测试的技术指标如下：

（1）性能技术指标

①x轴、Y轴及Z轴分辨率；

②时间分辨率；

③荧光滤色块配置；

④激光光斑是否居中；

⑤激光波长种类及功率；

⑥镜头倍数及数值孔径等参数，镜头平场特性，视场是否均匀；

⑦载物台适配器的种类，是否玻片、培养皿、多孔板均可用；

⑧有高灵敏度探测器的，如Leica SP8上有Hy D检测器，须检测其灵敏度配置。

（2）功能技术指标

①单荧光通道扫描；

②多荧光通道扫描；

③多层（Z-stack）扫描；

④时间序列扫描；

⑤多点扫描；

⑥拼图扫描（stitching）；

⑦光谱扫描；

⑧线扫描；

⑨明场微分干涉相衬（differential interference contrast，DIC）拍摄；

⑩明场、多荧光、多点、多层长时间活细胞序列拍摄；

FRAP、漂白荧光丢失（fluorescence loss after photobleaching，FLIP），FRET实验及后续分析；

软件分析功能（如三维、荧光强度、空间测量、追踪、共定位等）；

钙流（动态荧光强度测定）；

光漂白及光毒性。

实验方法：

①单光子激光共聚焦显微镜在488 nm激光的照射下，理论x Y轴分辨率约在260 nm，因此选用已商业化标准尺寸直径200 nm大小的荧光微球，使用仪器对其进行扫描，可判断x轴、Y轴及Z轴分辨率。

②制作组织样品时，组织经过石蜡包埋切片或者冰冻包埋切片以后，利用染料进行染色或者荧光标记。组织切片面积一般较大，用以检验仪器的拼图扫描功能；也可不染色或标记，看明场DIC条件下的拼图扫描是否有明显的接缝。

③制作固定细胞。将活细胞固定破膜后，利用免疫荧光标记的方法，标记一个或多个荧光染料（DAPI／FITC／TRITC／CY5），进行单荧光及多荧光通道的多层扫描实验，用以检测激光波长种类和功率、镜头放大倍数与不同数值孔径的成像效果。

④制作活细胞样品时，最好选取贴壁细胞，铺在玻璃底直径35 mm培养皿上，可以将荧光蛋白接到目标蛋白质上，然后转染融合蛋白的质粒，在细胞内表达。这样的样品被用来检测仪器的多荧光、多点、多层、长时间序列拍摄。经过长时程拍摄后，观察细胞的生存及荧光情况，用以检测温控、湿度、CO2孵育小室是否正常，还有焦面稳定性是否得到保证。

⑤制作荧光标记Ca2+，用Ca2+的染料直接标记上去即可。Ca2+由于反应速度快，被用于检测仪器的线扫描及最快扫描速度。

⑥利用上述实验的数据，对所得图像进行荧光强度、空间测量、追踪、共定位等软件分析，观察共聚焦设备上软件分析功能的实用性、稳定性及真实性。

⑦FRAP实验可利用荧光标记的活细胞样品，选取区域进行漂白，观察漂白的效果及恢复情况，利用软件分析荧光漂白的恢复情况。

⑧FRET实验分为2种。一种是将青色荧光蛋白（cyan fluorescent protein，CFP）和黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）都接到目标蛋白质上，然后把融合蛋白的质粒转染到细胞中，通过漂白受体YFP的区域，观察YFP的荧光恢复情况，得出能量共振转移的效率。另一种实验需要准备3个样品，分别单独将CFP、YFP以及CFP和YFP两者接到目标蛋白质上，然后把相应的融合蛋白质粒转染到细胞。最后通过软件计算的方法，分别得出能量共振转移的效率。

2.双光子显微镜

1台，型号为Olympus FV1200MPE（图8-4）。

该显微镜系统由1台正置双光子显微镜和1台倒置单／双光子显微镜组成。倒置与正置显微镜共享双光子激光器。倒置显微镜既可以做单光子实验，也可用于双光子显微成像。倒置和正置的部分，分别可得50%的双光子激光，用于2台同时成像；也可将100%的双光子激光，分配给正置部分或者倒置部分。设备布置如图8-4。

图8-4　双光子显微镜（彩图见图版第30页）

从左至右依次为双光子倒置部分、双光子正置与倒置整体共享光路和双光子正置部分。

在仪器调试阶段，除常规的试验样品及耗材外，还应提前准备如下试验样品：

①胶原丰富的组织（新鲜的小鼠尾巴）；

②脑组织切片（200～500μm）；

③斑马鱼样品、透明化处理的小鼠脑；

④固定细胞样品：标记filipin（一种抗生素，标记胆固醇）。

除常规检测外，对仪器进行以下项目检测：

（1）性能技术指标

①双光子激光器功率；

②磷砷化镓（Ga AsP）检测器的灵敏度和滤块配置；

③双光子激光可变波段及可变步径；

④双光子激光器扫描厚度；

⑤双光子x轴、Y轴及Z轴分辨率；

⑥双光子扫描速度；

⑦双光子用长工作距离红外高通水浸物镜效果；

⑧Z轴防漂移系统（zero drift compensator，ZDC）作用效果，看是否可以保证焦面稳定。

（2）功能指标

①二次谐波（非线性光学实验）；

②厚样品扫描；

③软件分析功能（侧重三维重构的解析功能）。

实验方法：

①切下小鼠的尾巴，直接放在显微镜下进行二次谐波实验，波长880±50 nm进行扫描，找出最适激光。

②斑马鱼样品和透明化处理的小鼠脑，主要用于检测双光子的最大扫描深度。

③样品为固定细胞时，活细胞须在固定破膜之后，利用免疫荧光标记的方法，flipin（一种抗生素，双光子激发波长为720 nm）标记胆固醇，进行扫描实验。

8.3.3.2　转盘式激光共聚焦显微镜模块

共1台大型设备，即转盘式激光共聚焦显微镜，型号为Zeiss Cell Observer SD。

该显微镜系统是基于微透镜增强技术的双转盘式激光共聚焦显微系统，特点是可以进行活细胞、长时程、快速、多维、多荧光通道拍摄，因此在拍摄过程中，细胞的活性及设备是否稳定是重要的检测指标。配备有405 nm／488 nm／561 nm／635 nm激光器，可支持SD（spinning disk，转盘）采图，全内反射荧光（TIRF）光路也有光纤进入，共用光源。共有3个相机，转盘式激光共聚焦部分有2个相机。当采集双荧光通道图像时，2个相机分别同时进行采集（如图8-5），可满足快速成像的需求。

图8-5　转盘式激光共聚焦显微镜（彩图见图版第31页）

黄色框内为SD左侧和上侧的2个EMCCD（背照式冷却CCD）。红色框内为TIRF光路信号采集相机。

在仪器调试阶段，除常规试验样品及耗材，还应提前准备如下试验样品及耗材。

①TIRF样品（标记贴壁细胞的跨膜蛋白质：单标488 nm激发荧光素或荧光蛋白；单标561 nm激发荧光素或荧光蛋白；双标488 nm和561 nm激发荧光素或荧光蛋白）。

②荧光标记Ca2+的样品。

③活细胞样品（多荧光标记样品：DAPI／FITC／TRITC／CY5）。

除常规项目检测外，对仪器进行以下项目检测：

（1）性能技术指标

①最快扫描速度。

②EMCCD^[3]是否具备高灵敏度、大靶面的性能，分辨率如何？

③焦面是否稳定？在应用完美聚焦模块情况下和不应用情况下分别检测。

④光漂白及光毒性。

⑤TIRF光路及镜头。

⑥色差。

（2）功能技术指标

①活细胞长时间序列拍摄（温控、湿度、CO 2孵育小室）。

②软件分析功能（如荧光强度、空间测量、追踪、共定位等）。

③488和561 nm双通道同时TIRF实验；488 nm单通道TIRF实验；561 nm单通道TIRF实验。

④双相机EMCCD同时成像。

⑤钙流（最快扫描速度及动态荧光强度测定）。

关于实验方法，TIRF样品一般是标记贴壁细胞的跨膜蛋白质，可准备双标488和561 nm激发荧光素或荧光蛋白的样品，用以做单独488或者561 nm通道的TIRF实验，以观察是否可以把现有分辨率提升至TIRF水平。由于488和561 nm波长不同，折射角度不同，2个通道同时做TIRF实验，可检测仪器是否能自动切换不同的全内反射角度，从而实现双通道同时成像的目标。对上述TIRF实验的数据进行荧光强度、空间测量、追踪、共定位等的软件分析，观察其设备的稳定性和分辨率水平。

8.3.3.3　超高分辨率显微镜模块

共2台大型设备，包括1台Nikon结构照明超高分辨率显微镜（SIM）和1台随机光学重构超高分辨率显微镜（STORM）（图8-6）。SIM配备了Ti-E全自动倒置显微镜、405 nm／488 nm／561 nm／640 nm激光器、高灵敏度EMCCD、完美聚焦系统、压电陶瓷载物台（piezo stage）、高灵敏度Z轴控制和高性能软件控制系统，配备了CO 2恒温恒湿室，具有2D-SIM、3D-SIM和全内反射结构照明（TIRF-SIM）成像模式，可实现几乎2倍于传统光学显微镜的分辨率，x Y轴分辨率最高可达100 nm。可进行多通道、多层扫描，对固定细胞或活细胞荧光样品及组织样品进行超高分辨率成像。随机光学重构超高分辨率显微镜（N-STORM）配置了Ti-E全自动倒置显微镜、高灵敏度EMCCD、完美聚焦系统、405 nm／Ar+／561 nm／647 nm激光器，具有2D-STORM和3D-STORM成像模式，可同时进行三通道扫描，x Y轴最大分辨率可达20 nm，Z轴分辨率最高可达50 nm。配合光激活／光转换荧光分子，可进行多色超高分辨率显微成像，从纳米尺度研究细胞内分子结构、定位以及相互作用。

图8-6　超高分辨率显微镜现场图

1.超高分辨率显微镜

1台，型号为Nikon N-SIM。该显微镜系统是基于结构照明技术，通过分析采用已知的高频条纹照明装置对标本照明所产生的莫尔纹，来看清楚细胞超微结构的成像系统。特点是与Nikon CFI Apo TIRF 100×油浸物镜（NA 1.49）结合使用，最高可达到约85nm的空间分辨率，并能提供微小细胞内结构及其相互作用功能的细节影像。

在仪器调试阶段，除常规样品和耗材以外，还应提前准备如下试验样品。

①100 nm直径的荧光微球。

②TIRF样品（标记贴壁细胞的跨膜蛋白质：单标488 nm；单标561 nm；单标647 nm；双标488、561 nm）。

除常规检测外，对仪器进行以下项目检测：

（1）性能技术指标

①TIRF-SIM／2D-SIM／3D-SIM模式x YZ空间分辨率；

②TIRF-SIM／2D-SIM／3D-SIM模式扫描速度；

③SIM激光器种类及功率；

④细胞孵育小室系统是否能实现温控及持续稳定的CO 2供应。

（2）功能技术指标

①TIRF-SIM模式扫描；

②2D-SIM模式扫描（单荧光通道及多荧光通道）；

③3D-SIM模式扫描（单荧光通道及多荧光通道的Z-stack多层扫描）；

④活细胞长时间存活培养（温控、湿度、CO2孵育小室）。

实验方法：

①在开始实验之前，首先要进行光路校准。首先校正激光光斑的位置，其次是调节物镜，校正环位置，最后对光栅格子的位置进行校准。(www.xing528.com)

②TIRF样品一般是标记贴壁细胞跨膜蛋白质，可准备双标488和561 nm的样品，用以做单独488或者561 nm通道的TIRF实验，以观察TIRF状态下的分辨率。

③利用实验中所采集和获得的原始图像，通过调整重构参数，对图像进行SIM算法的运算，获得大约100 nm分辨率的超高分辨率图像。TIRF-SIM、2D-SIM、3D-SIM均须接受测试。

2.单分子荧光超高分辨率显微镜

1台，型号为Nikon N-STORM。该显微镜系统是基于随机光学重构显微技术的成像系统。其特点是具有极高的空间分辨率，横向分辨率接近20 nm，轴向分辨率接近50 nm，N-STORM将光学显微镜的分辨能力延伸到了前所未有的分子水平。

在仪器调试阶段，厂商工程师和我方工作人员应提前准备如下实验样品：

①100 nm直径的荧光微球；

②Alexa405-Alexa647配对染料标记靶分子的样品；

③Cy2-Alexa647配对染料标记靶分子的样品；

④Cy3-Alexa647配对染料标记靶分子的样品。

对仪器进行以下项目检测：

（1）性能技术指标

①STORM空间分辨率；

②STORM扫描速度；

③激光器种类及功率；

④Nikon CFI Apo TIRF 100×油浸物镜（NA 1.49）（镜头平场特性如何，视场是否均匀）、STORM滤光块配置；

⑤TIRF光路配置。

（2）功能技术指标

①TIRF-STORM模式扫描；

②2D-STORM模式扫描；

③3D-STORM模式扫描；

④NIS AR软件六维分析模块功能、STORM分析模块及其他常规软件分析功能（如荧光强度、空间测量、追踪、共定位等）。

实验方法：

（1）染料制备、抗体标记

①材料和试剂

推荐使用的二抗：

a）驴源抗大鼠二抗（AffiniPure donkey anti-rat IgG（H+L）#712-005-153[Jackson Immuno Research Europe]）；

b）驴源抗兔二抗（AffiniPure donkey anti-rabbit IgG（H+L）#712-005-152[Jackson ImmunoResearch Europe]）；

c）驴源抗小鼠二抗（AffiniPure donkey anti-mouse IgG（H+L）#712-005-151[Jackson ImmunoResearch Europe]）。

荧光试剂：

Alexa Fluor 647羧酸；琥珀酸酯（Alexa Fluor 647 carboxylic acid，succinimidyl ester，1 mg#A20006[invitrogen]）。

活化剂染料：

a）Alexa Fluor 405羧酸，琥珀酸酯（Alexa Fluor 405 carboxylic acid，succinimidyl ester，1 mg#A30000[invitrogen]）；

b）Cy2染料（cy2 bis-reactive dye pack 5 vials#PA22000[GE Healthcare]）；

c）Cy3染料（cy3 mono-reactive dye pack 5 vials#PA23001[GE Healthcare]）。

其他试剂：

a）无水二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，anhydrous，≥99.9% #276855-100 ml[sigma-aldrich]）；

b）磷酸盐缓冲液[phosphate-buffered saline（PBS），1×]。

设备：

a）NAP-5柱子（NAP-5 columns#17-0853-02[GE Healthcare]）；

b）蒸发器（evaporator，例如Vacufuge®EF27220B[Eppendorf]）；

c）振动平台（shaking platform）；

d）紫外／可见光吸收分光光度计（UV／visible absorption spectrophotometer）。

②步骤

a）染料储液的配制：溶解1.0 mg Alexa染料于无水二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，anhydrous，DMSO）（100μl DMF则更好），使终浓度为10μg／μl，每管分装1μl，-20℃保存。CY染料溶解一小包（1 mg）于DMSO（20μl DMF则更好），每管分装1μl，终浓度为50μg／μl，4℃保存。

b）配制标准1倍浓度的磷酸缓冲盐溶液（PBS再加上NaN3也就是叠氮化钠的终浓度为2μmol／L）、1 mol／L NaHCO3、50%乙醇。用PBS配置终浓度为1.25 mg／ml的二抗。

c）蒸干器蒸干DMSO。二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）无须蒸干。储存染料。

d）取出一管染料，用DMF稀释5倍。

■1μl的Alexa染料储液加上4μl的DMF，浓度为2μg／μl；

■1μl的CY染料储液加上4μl的DMF，浓度为10μg／μl。

e）混合试剂：按顺序加。

■单标：50μl二抗（1.25 mg／ml溶于PBS）+1.5μl Alexa647+6μl 1 mol／L Na HCO3；

■双标：50μl二抗（1.25 mg／ml溶于PBS）+1.5μl CY3储液（或4μl的Alexa405储液／5μl的CY2储液）+0.6μl Alexa647储液+6μl 1 mol／L Na HCO3溶液。

f）室温下，避光，摇床反应30 min。

g）反应期间平衡NAP-5凝胶柱子（每个反应1根柱子）。用PBS过3次柱子，防止起泡。

h）加大概140μl的PBS，将反应体系的体积增加至200μl，轻轻地混合均匀。

i）将反应液全部加到柱子的中心，避免产生气泡。

j）等样品全部进入柱子，加入550μl的PBS清洗。

k）当染料前段到达出液口，不再滴液时，将柱子放在1.5 ml离心管上，尽量保持柱子垂直，加300μl的PBS，收集洗脱液于1.5 ml离心管。

l）所有反应重复以上实验步骤f—k。

m）用紫外分光光度计测定标记荧光二抗的吸光度。

n）柱子可以回收使用。用50 ml的PBS洗脱，再加15 ml 50%的乙醇洗脱，最后加50%的乙醇，4℃保存。

8.3.3.4　高通量细胞分析模块

共有5台大型设备。

1.高通量细胞分析仪

1台，型号为ThermoFisher，Cellomics ArrayScan VTI 700（图8-7）。该分析仪包括VTI主机、硬件聚焦模块、活细胞培养模块、发光二极管（light emitting diode，LED）光源、控制装置及软件、共聚焦模块、明场相差观察模块。配有单孔实时加样附件，可实现边加液边实时获图的功能，用以开展实时药物刺激、钙流检测等实验。

图8-7　高通量细胞分析仪

实验样品：

①标准样品96孔板和组织样品载玻片。

②标记多色293T细胞样品（多荧光标记样品：DAPI／GFP，测定GFP转染效率样品）。

③标记多色固定细胞样品（多荧光标记样品：DAPI／GFP／CY3，细胞自噬样品）。

④组织切片样品（染色组织薄片或切片，如小鼠小肠，观察小肠淋巴B细胞）。

⑤Jurcat活细胞样品（多荧光标记样品：Hoechst／FITC／TRITC／CY5，实时药物刺激）。

对仪器进行以下项目检测：

（1）性能指标

①测试载物台x、Y、Z轴的精度及重复性。

②最快扫描速度，即96孔板进行双色荧光和单色荧光扫描的速度。

③测试2.5×、5×、10×、20×、40×和63×长工作距离自动对焦物镜。

④自洁、抗菌、封闭的活细胞培养环境室，连续测试活体样品120 h以上。

⑤测试共聚焦成像在不同Z片层间距的精度值。

（2）功能指标

滤光片系统，具有5组发射自动滤光片轮，无须激发滤光片，提高扫描速度。

①测试自动加样、移液、分液、分配、洗涤、稀释的步骤，可调体积和加液方式；测试不同微孔板和载玻片，组织切片；测试最大视野校正后的扫描；测试厚底、薄底或者玻璃及有机树脂等材质的多孔板的聚焦效果。

②对于多通道荧光扫描，同时进行5个荧光通道的检测，测试各通道荧光信号，及与明视野图像的叠加效果。

③对于单通道荧光扫描，以Hoechst对细胞核染色，测试能否达到40块96孔板／d；对于活细胞实时监控图像的获取，测试能否达到8块96孔板／d。

④对于6种波长的荧光图像或图像融合进行分析，以系统自带的图片进行靶点激活、空间分析和形态分析模板的分析等。

⑤测试分析软件，远程登录后进行HCS（high content screening，高内涵筛选）计算。

2.自动移液工作站

1台，型号为Beckman Biomek FXP（图8-8）。自动移液工作站是配合高通量细胞分析仪，实现样品制备功能的多功能液体处理系统。同时配备自动分液器、洗板机、封膜机，全面保障多孔板细胞样品的制备技术需求。

图8-8　自动移液工作站

实验材料：

①Biomek AP96 P20 Tips（枪头）、P250 Tips、P20 Tips、Span-8 P250 Tips各2盒；

②标准分液盒100μl和细管分液盒10μl各1个；

③96孔板和384孔板各6块；

④100μl移液器和1 000μl移液器各1支；

⑤超纯水1 L，纯水10 L。

对仪器进行以下项目测试：

（1）性能指标

①加样范围和加样精度的变异系数（coefficient of variance，CV）值。

②红外线光幕的反应快慢，如有物体闯入试验区时，测试机器感应后立即停止运行程序的反应时间。

③光学定位系统，定位是否精确、方便。

（2）功能指标

①联机检查各部分状态。

②编辑上枪头程序。反复上Tips枪头^[4]10次，确保每次所有的枪头能全部上紧，并准确打回枪头盒。

③编辑移板程序，测试微孔板在所有自动定位器（automation labware positioner，ALP）位置之间的移板动作，确保移板的稳定。

④编辑移液程序，与手持移液器移液量相比较，确定移液的准确性。

⑤编辑移液程序，重复孔之间所移液的量相比较，确定移液的重复性。

⑥测试条形码读码器的扫描正确率。

⑦测试整合的Multidrop Combi自动分液器和Biotek 405UV洗板机，测试整体运行速度与连贯性。

⑧清洁整机及环境卫生，签署安装报告，完成安装。

3.荧光激发细胞分选仪

图8-9　荧光激发细胞分选仪（彩图见图版第31页）

红色圈内为流式检测和分选部分。

1台，型号为BD Influx（图8-9）。该分选仪通过激光，激发高速流动的细胞或微粒所携带的荧光染料或荧光素，并检测由此产生的各种光信号，来反映各项待检测的指标。其特点是：测量速度快，特异性强，灵敏度高，并对感兴趣的细胞或者颗粒进行分拣回收[5]。

实验材料：

①3μm标准尺度的荧光微球。

②标本：活细胞悬浮液（经过免疫标记等处理）。

③上样管：12 mm×75 mm管，货号352063。

④接收管：12 mm×75 mm管、15 ml管、1.5 ml微量管，96孔板。

⑤鞘液：PBS液（pH：7.2～7.4）。

⑥清洗液：NaCl O溶液（有效Cl含量0.5%～1%）。

⑦消毒液：75%酒精。

（1）性能指标：

①配置4根激光器：488 nm激光器（200 m W）、640 nm激光器（120 m W）、355 nm激光器（100 m W）、561 nm激光器（150 m W）。4根激光器可同时使用。具备12色14参数的检测分析能力。

②仪器检测荧光灵敏度和信号分辨率。

③仪器在实验过程中的分析速度、分选速度和分选纯度。

（2）功能指标：

①测试1—6路不同细胞群多路分选，接收管可为12 mm×75 mm管、15 ml管和微量管；测试96孔板分选。分选结束后，再进行细胞培养，或者直接在显微镜下观察分选效果。

②测试单细胞分选能力。

③测试全自动实时液滴延迟校准系统。

④测试能否完全更换液路系统，即所有能接触到样本的管道，全部可以快速更换，以保证无污染的管道分选。

⑤对分选仓内进行紫外消毒，测试无菌分选。

⑥测试样品自动检测系统：在样品分选结束时能够自动停止分选，防止空气进入管路。

⑦软件系统：测试多层设门以及各种图形呈现方式；测试自动创建补偿调节窗口，设定补偿值，补偿方式为数字化矩阵补偿；测试是否支持在线补偿或脱机补偿，以及输出帧校验序列（frame check sequence，FCS）数据和pdf格式的检测报告。

4.流式细胞仪

2台，型号为BD LSR Fortessa和BD Calibur（图8-10）。流式细胞仪用于测量细胞大小、内部颗粒的性状，检测细胞表面和细胞质抗原、细胞因子、细胞内DNA与RNA含量等。它可以对群体细胞在单细胞的水平上进行分析，在短时间内检测和分析大量的细胞，并收集、储存和处理数据，从同一个细胞进行多参数的定量分析[5]。

实验材料：

①标准尺度的荧光微球：BD CST KIT、CALIBRITE 3 COLOR KIT、CALIBRITE APC微球。

②荧光标记细胞样品：单标FITC（488 nm）样品、单标APC（640 nm）样品、单标Per CP（488 nm）样品、三色标记样品（FTIC、APC、Per CP）。

③纯水。

④5 ml BD Falcon上样管，货号352008。

对仪器进行以下项目检测：

图8-10　流式细胞仪BD LSR Fortessa和BD Calibur

（1）性能指标

①激光波长种类及功率：BD LSR Fortessa配置4根激光器和14个检测器。BD Calibur配置2根激光器和6个检测器。

②光激发系统和光收集系统：在光胶耦合的石英杯流动池中激发，荧光信号通过连续反射的光信号收集器被检测，以验证激光延迟是否正确。

③激光是否与液流正交。

④荧光滤色块配置：BD LSR Fortessa滤光片放置方式为即插即拔式，不需要任何工具。

⑤脉冲处理信号：可以同时分析脉冲高度、宽度、面积和时间4种参数。

⑥荧光分辨率：CV＜3%。

⑦补偿方式：BD LSR Fortessa为数字化矩阵补偿、在线补偿或脱机补偿。

⑧荧光检测灵敏度：2台流式分析仪在FITC、PE、APC^[5]等各通道的灵敏度。

⑨最大分析速度：BD LSR Fortessa≥40 000个细胞／s，BD Calibur≥10 000个细胞／s。

⑩检测样品的最大流速。

仪器性能质控：具有流式细胞仪的设置和追踪功能，能够帮助仪器完成基线设置，并且优化灵敏度和荧光分辨率，大幅减少使用者的错误。同时，通过设置不同激光器之间的信号时间延迟及优化光电倍增管（photomultiplier tube，PMT）电压，确保实验结果的一致性与稳定性。软件具有质量控制的追踪能力，因此会检测仪器状态，并给出报告。

分析软件：软件系统能够自动化地获取程序预览，并记录多个样品的复杂数据。

（2）功能指标

①单荧光通道检测。

②多荧光通道检测。

③荧光补偿。

④软件分析功能，如多层设门、多种图形呈现、批量分析、设定补偿值等。