蛋白质的样品制备是蛋白质质谱分析整个流程的起始步骤，也是非常关键的一步。样本制备的好坏，决定了整个蛋白质组学分析的有效性和准确性。因此在系统建设过程中，设计了多种针对不同样本蛋白质提取的硬件配置，以及相应的蛋白质样本前处理的制备方案（图7-4）。另一方面，对于复杂的蛋白质样本如血液等来说，适当的分级处理或者高丰度蛋白质的去除，可以降低样本的复杂性，从而提高蛋白质鉴定的效率。从分级对象来看，有蛋白质和肽段两种不同水平；从分级方法看，有基于色谱的和基于电泳的两种常规方法。总体来说，样本的制备模块流程包括了蛋白质的提取、分级、酶解，以及多肽的脱盐、分级等多个步骤。
图7-4 样本制备模块的功能组织图
7.2.1 蛋白质样本提取
对于不同类型的样本，蛋白质的提取方法存在着较大差异性（表7-1）。常用的细胞破碎提取方法包括机械破碎法、物理破碎法和化学处理法几个大类。针对组织样本，一般需要采用液氮研磨、组织切割、破碎等方式，系统地完成高得率蛋白质的提取，以及特异区域的细胞蛋白质提取。对细胞样本，采用较为温和的破碎方法，如细胞匀浆等方式，即可获得全细胞蛋白质。液氮研磨或者细胞匀浆所需要的仪器设备，相对来说简单。对于复杂及较难破碎的组织样本，如鸡肉组织、植物组织、细菌等来说，需要借助一些特殊的仪器如组织研磨器或者超声破碎仪来进行处理，以破碎细胞并提取蛋白质。为了满足不同类型样本的需求，质谱系统设计配置了不同通道数的组织研磨器和超声破碎仪，与常规的蛋白质提取方法组成一个完整的蛋白质提取单元。7.2.1.1 组织研磨器
表7-1 常见的细胞破碎方法
根据不同实验的需要，系统配置了两款不同类型的组织研磨器，包括法国Bertin Minilys个人型均质器（图7-5）和OMNI Bead Ruptor24（图7-6）样品研磨均质匀浆仪。
Minilys是一款结构紧凑、高效小型的均质器（技术参数见表7-2），可快速、高效处理各类小通量生物样品（非常适合并主要用于提取DNA、RNA、蛋白质及药物等，可有效均质动植物组织、细菌、真菌，以及孢子、毛发、骨骼、粪便、土壤等一般仪器无法对付的样品），适于0.5、2、7 ml研磨管，操作方便。Minilys采用研磨珠敲打原理，是一种可靠、高效、快速的均质方式，可依据标准的实验方案及它本身独有的三维振荡模式，达到样品均质的目的。其主要特点如下。
①体积小巧，设计紧凑，移动方便。
②可有效处理动植物组织及细菌、真菌等。
图7-5 Minilys个人型均质器
图片转引自http://shop.71.net／Prod＿1126907305.html。
图7-6 OMNI BeadRuptor24样品研磨均质匀浆仪
图片转引自上海博谊生物科技有限公司网页。
表7-2 Minilys个人型均质器技术参数
*CE：欧盟统一认证；UL：美国保险商试验所认证。
③单样品管操作，不会出现交叉污染。
④可一次处理3个样品，普通样品20～60 s即可完全均质。
⑤三维振荡模式，比单纯往复式振荡效果更佳。
7.2.1.2 超声破碎仪
超声波破碎仪主要通过产生超声波能量，并利用钛（Ti）金属探头，将能量传导至液体样品。该过程导致气穴现象（微气泡在高剪切力作用下破裂），可用来处理不同类型的大样品。一般来说，可分为直接破碎和间接破碎两种方式，都是可行的，如何选择取决于具体应用。直接破碎时要将探头浸入样品容器，要能够快速和有效地处理大多数样品。间接破碎无须让探头和样品直接接触，允许用户处理封口的试管和样品瓶，需要配备角状杯来实现间接破碎（图7-7）。系统搭载的505型超声破碎仪（图7-8），能够传递更高的能量，可编程，适用于纳米技术、细胞破裂和均质应用，既可以处理小量样本，也可以处理大量样本，具备很好的兼容性（参数见表7-3）。有多种附件可供选择，包括单个样本的探头和间接破碎的角状杯。
图7-7 不同规格探头及备件
图片转引自http://yibiao.gongye360.com／prods＿view.html？prodid＝485929。
图7-8 505型超声破碎仪
图片转引自https：//www.tlyon.com／4642.html。
表7-3 505型超声破碎仪的技术参数
7.2.2 蛋白质样本的酶解
常规蛋白质组学技术采用的是“自下而上”（bottom up）的实验方案，蛋白质的酶解是其中关键的一步。如何高效地完成从较大分子量蛋白质到适合质谱检测大小的肽段的转化，会极大地影响整个实验结果的好坏。常规的处理方式采取金属振荡浴的方式，整个酶解过程通常需要酶解过夜。而采用微波酶解的方式，会大大加速这个过程，把酶解的时间从16 h缩短到0.5 h，非常高效。
图7-9 ThermoStat plus振荡金属浴
图片转引自http://yueqinghwel.m.sell.everychina.com／p-92360838-dual-thermostat-ntl-10a-10bthermostat.html。
7.2.2.1 振荡金属浴
ThermoStat plus振荡金属浴（图7-9）的设计配置，可以实现对所有实验室常用样品管的方便的温度控制，同时结合了Peltier半导体温控技术。其最显著的特点是，具有相当大的温控范围，最高至99℃；还配备了一个制冷装置，可使温度降到-5℃。
ThermoStat plus振荡金属浴可以提供适合0.2、0.5、1.0、2.0和15 ml的离心管，以及微孔板等不同类型规格样品管的加热模块，使用灵活，用途广泛。此外，ThermoStat plus恒温孵育器还可以配置一个加热模块——Eppendorf CombiBox，适合不同形状的、高度不超过60 mm的容器和大口杯的温度控制（表7-4）。
ThermoStat plus恒温孵育器操作简便，使用方便：简单地选择温度，然后按Start（开始）键即开始计时加热工作。对于一些特殊的应用，温度和运行时间均可以设置。在连续运行时，有多个温度和时间段可供选择。仪器特性如下。
①对实验室所有常用的样品管，进行精确的温度调控。
②温控范围在-5～99℃。
③温度和运行时间可分别设置：在连续运行时可设置最多4个不同温度和4个不同时间段。
④可单独设置2个温度水平之间线性转变的运行时间。
⑤操作便捷，按键无双重功能。
⑥可通过RS232接口，控制和记录仪器运行，符合《药物非临床研究质量管理规范》（GLP[5]）标准。
⑦安全可靠的24孔可更换式加热模块，适用于0.5、1.5或2.0 ml不同体积的离心管。
⑧可更换式微孔板加热模块，适用于所有型号的板材，包括深孔板、96×0.2 ml PCR管和96孔PCR板的适配板。
⑨适用于各类试管的可更换式加热模块，直径为11～12 mm，高度达30～76 mm。
表7-4 ThermoStat plus振荡金属浴技术参数
7.2.2.2 微波酶解仪
图7-10 微波酶解仪的原理图（彩图见图版第25页）
图片转引自https：//product.gongchang.com／c4245／CNC1101782581.html。
微波辅助酶解技术作为一种高效快速的蛋白质酶解技术，具有作用时间短，酶解速度快，酶解产物可控等特点，大大提高了蛋白质组学与生物标志物研究中样品前处理的效率，近年来被广泛应用于蛋白组学分析及多肽分离与分析之中。其主要原理（图7-10）是，通过用微波照射水分子，使电能转换为高频振动能，从而使样品池中水和样品的温度，均匀快速地升高，提高了有效碰撞和反应的效率，大幅减少了反应时间。微波酶解技术适用于电泳方法的样品制备和许多酶反应实验，如蛋白质组学中的蛋白质水解、脱糖基化反应、糖蛋白聚糖分离等。该技术不仅可应用到单一样品的制备，也可以扩展到多个样品的一次性制备，可用于大规模蛋白质消化或生物标志物的研究。
图7-11 CEM微波酶解仪
图片引自CEM公司产品说明。
质谱系统搭载了美国CEM公司的CEM Discover微波酶解仪（图7-11），该微波酶解仪采取了第三代微波化学技术，在300 ml大腔体内形成环形微波（见表7-5），并采用了Power MAX同步冷却技术，形成了具有多样性和精确性的多功能模块化平台。CEM Discover环形聚焦单模微波酶解仪的环形聚焦单模技术，被公认为第三代微波化学技术。它是CEM公司以传统单向驻波单模（第二代技术）为基础设计的。Discover SP单模微波合成反应器，已成为最知名的第三代微波化学技术标志。它使单模微波腔体从第二代30 ml扩展到300 ml，通过11通道自动高精度能量调节，以及完美的定量耦合能势阱效应，实现了单模平台高效精确的量和质的飞跃，奠定了同类单模产品所无法比拟的高端地位。
表7-5 CEM微波酶解仪技术参数
*psi：pounds per square inch（磅／英寸2），为非法定计量单位。1 psi＝6.895 kPa。
第三代微波化学技术，保证了反应边界条件的高定量性和重复性，突破了低温到高温、小样品到大样品、常压到高压，以及加气反应各种功能的自由扩展，使应用扩展到更多领域。它被成功地用于小分子合成、组合化学、药物化学、化工、材料、生物、中药萃取等，帮助化学家进行前沿性的研发。
Discover系列采用目前世界上最大专利的环形聚焦单模微波腔，以均匀的定量耦合、高密度的微波场、功率的稳定性，从根本上满足了微波辅助反应中微波场的可控性和可重复性等要求。对系统温度和压力的精确控制，以及内置的反应软件，使Discover系统可控且使用简便，可以说从药品研发到各种有机／无机合成及化学反应机理研究，Discover单模微波合成仪都能满足要求。
CEM Discover环形聚焦单模微波合成系统（微波合成仪）有如下技术优势。
①快速反应：微波比传统加热方式快10～1 000倍。
②提高产率：微波比传统方法提高50%～100%。
③极好的兼容性：可采用常压及高压两种反应方式，使用不同形状和体积的反应容器。
④完美的可扩展性：平台可扩展用于自动进样、放大反应、多肽合成、拉曼原位监控反应、超低温反应、组合化学工作站等，满足更多反应要求。
⑤独特的气体添加／连续流动组件，可用于加气反应和气体保护反应等特殊反应。
⑥专利的Power MAX技术：可以使化学反应体系获得更多微波能量，从而极大地提高许多困难反应及热敏反应的选择性、产率和产物纯度，并为研究新的合成路径提供条件。
⑦独特的反应附件：大大扩展了利用微波能量进行化学反应的范围，可以完成大部分热敏性反应，包括极高的反应速度和很高的反应产率。
7.2.3 蛋白质或多肽样本的分级(www.xing528.com)
从起始样本规模看，蛋白质或多肽样本可分为半制备级（针对1 mg及以上样本）和微量级（针对1 mg以下样本）。半制备样品分级系统配备了液相色谱仪1套、电泳仪1套。微量级样品分析系统配备了微升液相色谱仪2套。
7.2.3.1 液相色谱仪技术指标
1.四元泵
①串联双柱塞，主动电磁阀设计。
②可变冲程：20～100μl可调。
③带有在线真空脱气机。
④流速范围在1～10 000 ml／min，有1 ml／min增量。
⑤流量精度：≤0.07%相对标准偏差（RSD）或≤0.02 min。
⑥流量准确度：±1%或10μl／min。
⑦压力范围：0～40 MPa（0～400 bar，0～5 880 psi）。
⑧梯度混合精度：流速在1 ml／min时≤0.15% RSD。
⑨梯度混合准确度：±0.5%。
⑩控制：流速，梯度时间表（流速、组成、梯度模式）。
2.自动进样器
①可进行编程进样，用于柱前衍生等复杂进样方式。
②可根据样品的黏度，调节取样及进样的速度。
③进样范围在0.1～100 ml。
④进样精度＜0.25% RSD在5～100 ml；＜1% RSD在1～5 ml。
⑤残留：无自动洗针过程＜0.1%；有自动洗针＜0.05%。
⑥最小取样体积为0.1 ml。
⑦样品黏度范围在0.2～50 cP[6]。
⑧pH值范围在1.0～9.5。
⑨软件程序控制：进样体积、自动洗针程序、柱前自动衍生程序、取样及进样速率。
3.柱温箱
①控温范围：室温下10～80℃，通过宏命令可控制至90℃。
②控温速率：室温加热至40℃，5 min；由40℃降温至20℃，10 min。
③控温精度：±0.15℃。
④柱容量：30 cm×3根。
⑤性能：柱识别器记录色谱柱的使用次数及使用方法。
4.可变波长紫外检测器（variable wavelength detector，VWD）
①光源：氘灯。
②波长范围：190～600 nm。
③狭缝宽度：6.5 nm。
④光谱：停流扫描。
⑤检测通道：1。
⑥波长精度：1 nm。
⑦基线噪声：±0.75×10-5 AU，波长在254 nm（1 ml／min甲醇）。
⑧基线漂移：1×10-4 AU／h，波长在254 nm（1 ml／min甲醇）。
⑨线性范围：＞2 AU。
⑩测量范围：＞2 AUFS[7]。
响应时间：0.1～20 s。
可编程时间表：波长、峰宽、氘灯开／关、信号自动回零、峰反转、采样时间。
信号输出：1个输出，100 m V或1 V。
5.荧光检测器（fluorescence detector，FLD）
①性能：最低检测限为10 fg蒽。
②光源：氙灯。
③激发波长：200～700 nm。
④发射波长：280～900 nm。
⑤光谱存储范围：全光谱。
图7-12 OFFGEL等电聚焦系统
图片引自Agilent公司产品说明。
7.2.3.2 等电聚焦系统（isoelectric focusing，IEF）
采用安捷伦（Agilent）公司OFFGEL等电聚焦系统（图7-12）[6]，基于p I[8]的游离胶预分馏技术，便于和任何蛋白质以及多肽分离分析平台结合使用，用于相关样品的分离富集。其具体优势如下。
①便于跟任何蛋白质分析平台结合使用。无论进行生物标记研究、蛋白质分离，还是进行功能蛋白质的纯化，OFFGEL都能与任何蛋白质分析平台结合使用。整合OFFGEL系统的质谱分析，很容易得到高灵敏度的结果。
②基于等电点和液相技术的OFFGEL，易于回收样本，并应用到下游的技术操作中，如液相质谱分析。
③所处理的蛋白质溶液pH值低至0.1时，质谱的检测灵敏度仍旧很高。
④跟上下游的技术有很好的兼容性，如免疫共沉淀、液相-质谱连用或者凝胶分析技术。
⑤p I值可以作为质谱结果的补充参数，用于寻找被调控的转录后修饰蛋白质。
⑥通过仪器可以很容易地去除试验中加入的试剂，避免对电离或质谱检测造成干扰。
⑦在2个样品槽内，最多可处理16个样本（每个样品槽8个样本）。
⑧有宽广的上样能力，可进行50μg～5 mg样本的分析，或进行低丰度蛋白质样品的富集。
⑨OFFGEL和传统的等电聚焦，使用了固相的pH梯度胶。
⑩避免双向电泳后蛋白质的获得和溶解所造成的蛋白质损失。
OFFGEL等电聚焦系统的技术优势如下。
①溶液中的分离成分可以回收，方便了LC／MS[9]分析。
②2个电源设置允许同时分离2组浓度相差很大的样品。
③一次可以同时分馏多达16个样品。
④有OFFGEL（游离胶）或INGEL（传统IEF）两种模式可选。
⑤上样量的范围宽广，在50μg～5 mg之间。
⑥有很高的回收率，蛋白质＞70%，多肽＞80%。
⑦开放耗材：有多种固相pH梯度干胶条可供选择。
⑧可进行实时“诊断”，通过观察电流变化来判断样本的分离情况。
⑨简便，重现性好，容易使用。
⑩可以兼容多个系统完成一系列工作，例如整合多重亲和去除系统（multiple affinity removal system，MARS）、液相质谱联用以及生物分析仪等。
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