国家蛋白质科学研究设施设计与研制：科学目标与建设方案

7.1.1　质谱仪的发展历程

19世纪末期，人类在牛顿（I.Newton）力学、道尔顿（J.Dalton）物质原子理论、热力学、电磁学等物理学研究方面取得了非常大的进展，造就了物理学史上的又一个辉煌时期。在这样的物理大发现背景下，德国物理学家E.Goldstein于1876年提出了阴极射线理论。他认为在低压气体放电管玻璃壁上的辉光，是由阴极产生的某种射线引起的，并把这种射线命名为阴极射线。十多年后，W.C.Werner进一步研究发现，阳极射线所带正电量与阴极射线所带负电量相等，并根据它们在磁场和电场影响下的运动规律，得出阳极射线由带正电的粒子组成，电荷相同时质量小的离子偏转得多，质量大的离子偏转得少。这些实验现象的发现和理论的提出，奠定了后来质谱仪原型的理论基础。

基于这些早期物理学上的重大发现，从阴极射线中发现电子的英国著名物理学家J.J.Thomson和他的助手F.W.Aston利用Werner的方法，通过磁场使阳极射线的粒子发生偏转，并通过电场使具有不同电荷和质量的离子分隔开——首个扇形磁场质谱计模型，就此诞生于著名的卡文迪许（H.Cavendish）实验室：使离子沿抛物线飞行，将其轨迹记录到底片上，从而测定其精确质量。并且，利用这个质谱仪的设想，他们通过实验首次证明了氖（Ne）的2种同位素的存在。

1919年，Aston完成了第一台真正意义上质谱仪的研制，它升级改造后，更能分辨1%质量单位。借助这些具备电磁聚焦性能的质谱仪，Aston发现了多种元素同位素，研究了53个非放射性元素，发现了天然存在的287种核素中的至少212种，第一次证明了原子质量亏损。并且，通过对大量同位素的研究，他阐述了“整数法则”，即：除了H以外的所有元素，其原子质量都是H原子质量的整数倍。并且，通过质谱分析，他解释了造成实际值与上述法则偏差的原因是同位素的存在。他为此荣获1922年的诺贝尔化学奖。

1940年以前，质谱计作为一种分析手段被化学家采用，用于气体分析和测定化学元素的稳定同位素。从40年代开始，质谱法开始被用来对石油馏分中的复杂烃类混合物进行分析，并证实了复杂分子能产生确定的、可重复的质谱谱图，之后才被用于测定有机化合物的结构，开拓了有机质谱的新领域。随后，四极杆质量分析器（1953年）、离子阱质量分析器、串联质谱系统（1954年）和飞行时间质谱仪（1955年）亦相继问世。特别是离子阱质量分析器中的傅里叶变换离子回旋共振质谱仪，具有超高的分辨率和准确度，而且数据采集速度快，可与多种离子化方式衔接，可进行多级质谱（mass spectrometry，MS）检测，在化合物相对分子质量测定、结构信息获取及反应机理的研究等方面，发挥着重要的作用。20世纪80年代，随着快原子轰击、电喷雾和基质辅助激光解吸等新的“软电离”技术出现，质谱仪的应用被推广到高极性、难挥发和热不稳定样品，特别是蛋白质样品的分析。生物质谱仪飞速发展，已成为现代科学前沿的热点之一。

7.1.2　科学目标

20世纪50年代，生命科学领域以“中心法则”的建立为标志（图7-1），研究者们逐步开始探索控制生命活动的基本分子机理。进入21世纪以来，随着人类基因组计划的完成和相关质谱技术的进步，人们逐渐开始重视和开展蛋白质组学以及代谢组学的研究，乃至于进行多组学的联合研究工作，以解决生命的复杂性和多样性问题。除此之外，研究者还发现，作为生命活动基本“元件”的核酸、蛋白质和糖脂等生物大分子，同时处于机体内广泛的动态化学修饰之中，并在机体的生命活动中扮演了关键的角色（图7-2）。而生物大分子特别是蛋白质的多种动态化学修饰，大大丰富了其在生物体内的功能作用。针对这些重要问题的研究，已成为当前生命科学最受关注的领域之一。

图7-1　“中心法则”的意义

脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）反映了细胞未来的潜能，告诉你哪些事情可能发生；核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）揭示了细胞发展的方向，告诉你哪些事情将要发生；蛋白质（protein）则显示出了细胞的各项功能元件，告诉你细胞的各项变化是由哪些元件完成的；而代谢物（metabolite）是最后发生各种变化的产物，告诉你细胞中正在发生的变化。遗传信息（information）由上而下传递，物质（material）基础由外而内展现。

质谱法是一种与光谱法并列的谱学方法。它利用微观物质在质量上的差别所带来的物理性质或现象的不同，来对微观物质进行区分。简单说来，它就是通过对微观粒子气相离子的质荷比（质量／电荷的比值）^[1]测量，来鉴定化合物的一种专门技术，被广泛应用于各个学科领域。人们把基于质谱技术对生物大分子特别对蛋白质的高通量研究方式，简称为蛋白质组学（proteomics）[1]。它是研究细胞或者某种生物体内所表达的全部蛋白质情况的方法，包括蛋白质表达水平、结合方式、蛋白质翻译后修饰情况等。基因组的重要性不言而喻，然而蛋白质才是执行生命体功能的基本单元，它通过形成各种复合物，组成通路网络，来行使复杂多样的生物学功能。所以，有很多生物学问题需要在蛋白质层面上进行研究和探索，而且要站在系统的层面去考察，例如蛋白质-蛋白质相互作用[2]、蛋白质的细胞定位、蛋白质翻译后修饰[3]、信号通路及代谢通路的调控和功能等。

图7-2　多组学分析：针对不同层面的组学交叉结合，开展生物学问题的研究（详见下载图7-2，下载网址见31页脚注）

对脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的研究形成了基因组学（genomics），对蛋白质的研究形成了蛋白质组学，对小分子代谢物（small molecular metabolite）的研究逐步形成了代谢组学（metabolomics）。不同层次的研究相结合，又形成了转录组学（transcriptomics）、功能蛋白质组学和基因组学（functional proteomics／genomics）等研究方向。

基于此发展背景，蛋白质修饰与相互作用分析系统，主要通过基于先进质谱技术的蛋白质组学方法，对蛋白质进行高分辨、高准确性的鉴定，确定蛋白质在功能系统中所起的重要作用，并结合结构分析和分子影像分析等多种技术方法，发现蛋白质的功能。通过质谱分析，定位发生在蛋白质上的修饰位点，进一步指导蛋白质结构的测定和功能分析。此外，通过对重要功能蛋白质的精确定量分析，可追踪在不同时间和处理条件下的蛋白质结构变化，从而为解释细胞活动的分子机制，筛选疾病生物标志物和药物靶点，提供分子基础。

7.1.3 建设方案

系统总投资5 340万元，建设周期约为3年。计划初步建成一个国际领先的、能提供全方位蛋白质鉴定和修饰分析，并具备强大定量分析功能的蛋白质修饰与相互作用分析系统。可以为细胞活动的分子机制研究、疾病相关生物标志物的筛选和药物靶点的发现，提供很好的技术支持。

蛋白质修饰与相互作用分析系统，从生物学研究的需求上将初步建设构成4个基本功能模块：样本制备模块；蛋白质高分辨鉴定模块；蛋白质修饰规模化分离和定位模块；功能蛋白质及其相互作用的定量分析模块。4个模块采取灵活的串接或并接模式，实现系统集成和优化。关键设备主要包括11台功能互补的高性能质谱仪。系统构成如图7-3。

图7-3　质谱分析系统的最初设计组成^[2]

在样品制备模块中发展各种形式的色谱分离方法，在蛋白质水平、肽段水平和修饰水平形成多种兼容互补的样品前处理及分离平台。在蛋白质方面，形成以亲和色谱、离子交换和分子排阻等方法为主的高选择性分离模式；在肽段方面，构建基于微升和纳升规模的多维色谱系统，用于肽段的分级，从而提高蛋白质的鉴定覆盖率。

7.1.4　性能指标(www.xing528.com)

系统由4大模块组成，模块间采用并联和串联模式，各模块间可快速切换组装，多维色谱和质谱之间能实现在线高灵敏度串接，能快速实现对复杂样本的蛋白质高灵敏度鉴定、蛋白质修饰分析和相互作用分析，以及精确定量分析。关于预期具体指标说明如下。

7.1.4.1　样本制备模块

1.指标

对细胞和组织样本的蛋白质提取，可达到10批／d。蛋白质酶解通量可达到50个／d。酶解时间可达2 h以下，可同时处理样本超过24个。

2.定义

建立多种蛋白质提取模式，并实现流程化。采用微波或高压模式，使酶解时间最短降低到2 h以下，比现有常规速度提高8倍。采用多通道酶解模式，能同时处理的样本超过24个。对该模块选取动物（包括组织和细胞等）、植物（包括组织和细胞等）、细菌各一种模式生物作为测试对象，检测蛋白质提取的效率和速度。酶解部分选取标准蛋白质、蛋白质混合物和动物细胞样本进行测试。亚细胞分级部分采用动物组织和细胞各一种进行分级效果评价。

7.1.4.2　蛋白质的高分辨鉴定模块

1.指标

以基质辅助激光解析串联飞行时间质谱^[3]和液相色谱／质谱为核心，进行蛋白质鉴定。技术规模达到2 000个蛋白质／d。灵敏度达到亚飞摩尔（fmol），鉴定假阳性＜1%。对特定蛋白质鉴定氨基酸的覆盖率达到30%以上。

2.定义

以哺乳动物细胞或组织蛋白质酶解肽混合物为样本，蛋白质鉴定规模达到2 000个蛋白质／d，其肽段的假阳性率小于1%。对标准蛋白质检测的灵敏度达到亚飞摩尔。对标准蛋白质鉴定氨基酸的覆盖率达到30%以上。

7.1.4.3　蛋白质修饰的规模化分离和定位模块

1.指标

蛋白质翻译后修饰的分析规模达到50个位点／d，灵敏度为飞摩尔。修饰位点定位误差＜1%，蛋白质翻译后修饰的检测种类达到10种以上。

2.定义

以哺乳动物细胞或组织蛋白质酶解肽混合物或标准肽混合物为样本，主要以磷酸化修饰为例，分析规模达到50个位点／d，修饰肽段的鉴定假阳性要小于1%。对合成磷酸化肽段的检测灵敏度达到飞摩尔。主要以合成修饰肽、已知修饰蛋白质或哺乳动物细胞蛋白质酶解肽混合物为标准，检测包括氧化、甲基化（一甲基、二甲基、三甲基）、乙酰化、磷酸化、硝基化、亚硝基化、泛素化、类泛素化、N 糖基化、O 糖基化、脂酰化、羰基化等至少10种蛋白质的翻译后修饰。

7.1.4.4 功能蛋白质及其相互作用的定量分析模块

1.指标

建立蛋白质体外和体内、相对和绝对定量方法。蛋白质体外和体内相对定量的规模达到200个／d，定量误差＜30%。蛋白质绝对定量规模可达到50个／d，定量误差＜20%。

2.定义

以哺乳动物细胞或组织蛋白质酶解肽混合物为样本。体外相对定量是指体外稳定同位素化学标记法，如TMT技术或者iTRAQ技术[4]；体内相对定量是指稳定同位素掺入培养细胞的方法，即SILAC技术[5]。相对定量的规模达到200个／d，定量误差即相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）小于30%。蛋白质绝对定量指以合成稳定同位素肽段为内标的多反应监测方法（MRM）^[4]，绝对定量规模可达到50个／d，对标准蛋白质的定量误差＜20%。