电镜系统包含有3个模块——样品制备模块、数据收集模块（电镜）和数据分析处理模块。关键设备包括3台冷冻透射电镜、若干台高配置的制样设备以及高性能运算处理设备。
6.5.1.1 验收指标
完成1个或多个分辨率在2～10 nm的细胞或细胞器等大尺度生物结构的电子断层三维重构。
6.5.1.2 测试方法：电子断层三维重构与冷冻透射电镜观察
1.脂质体样品制备
（1）分别取DOPC 60μl和Ni-DOPC[10]20μl，混匀之后放置在通风橱中约2 h。
（2）待干燥后加入Tris-NaCl[11]缓冲溶液（pH 8.0），用移液枪枪头吹打均匀之后，转入脂质体微型挤出仪（Avanti Original mini-extruder design）的250μl注射器中。按照脂质体微型挤出仪的使用说明，来回抽吸10 min左右（使用0.2μm规格的过滤膜过滤）。待乳白色的脂质体液体变得均匀透明之后，转移到离心管中备用。
（3）取直径为10 nm的纳米金颗粒100μl，超声破碎30 min备用。
（4）取制好的脂质体6μl，加入金颗粒14μl，进行制样；或者取制好的脂质体6μl，加入1μl（浓度0.5 mg／ml）对照蛋白质SDK1[12]，5 min后加入金颗粒13μl，进行制样。
2.快速冷冻样品制备
（1）清洗铜网：将Quantifoil铜网（400目）放置于干净玻璃皿内，用丙酮浸泡1 d之后取出铜网，用无水乙醇清洗3次，自然晾干。
（2）亲水化铜网：取清洗过的干燥铜网1枚，利用光学显微镜观察碳膜状态，确定铜网上碳膜完整，无大面积破裂。将铜网放置于等离子清洗仪内，氢气（H 2）和氧气（O 2）为1﹕1的比例。铜网亲水化10 s。
（3）用自动冷冻制样仪制备样品：用液氮液化乙烷气体，使之形成液态乙烷。利用自动冷冻制样仪快速冷冻制样设备。将点在铜网上的脂质体样品，经由液态乙烷冷冻，在毫秒时间内制成冷冻样品，使样品得以保存在与水环境极为相似的环境中。自动冷冻制样仪参数设定为：滤纸吸附时间（blot time）5 s，滤纸吸附力度（blot force）0。制样之后，样品放入液氮中保存，待电镜观察。
3.冷冻电镜观察
设备参数与设置为：加速电压200 kV；放大倍数50 000倍；运用FEI TEM Tomography（X射线断层摄影）软件，正负倾转65°。调节相应参数，收集数据。
4.软件重构
将电镜采集得到的mrc格式文件导入Ispect 3D软件，通过计算处理，得到样品倾转的动态结果，保存为avi格式导出。也可以重构得到rec格式文件后，再导入Amira软件渲染，最终保存为avi格式导出。
6.5.1.3 测试设备及结果
（1）测试设备：Tecnai G2 F20冷冻透射电镜。
图6-30 脂质体电子断层三维重构示意图（用上海设施Tecnai G2 F20冷冻透射电镜拍摄）
（2）测试结果：如图6-30所示，脂质体双层膜结构清晰可见，分辨率在2～10 nm左右。
6.5.1.4 测试结论
测试结果满足测试指标。
6.5.2 可解析的分子量范围
6.5.2.1 验收指标
利用负染等方法，将可解析的分子量范围进一步延伸到100 kDa。
6.5.2.2 测试方法：负染与常温透射电镜观察
1.蛋白质样品
蛋白质DEC-205是免疫细胞表面受体蛋白，胞外区域有180 kDa，通过镍柱亲和纯化。纯化后经过稀释，制备成浓度约50μg／ml的蛋白质样品。
2.负染样品制备
（1）用蛋白质样品湿润铜网：取铜网1张，用移液枪滴一滴蛋白质样品在铜网上，用滤纸将残余蛋白质样品吸走。之后，再在铜网上加入5μl样品，静置1 min。
（2）染色：在静置1 min之后，滤纸吸走残余蛋白质溶液。加入5μl醋酸铀染液，然后用滤纸将残余染液吸走。再次加入5μl醋酸铀染液，静置1 min以后用滤纸吸干。
3.透射电镜观察
高压120 kV，放大倍数为96 000倍。相机参数为像素合并（binning）1，曝光时间1 s。
6.5.2.3 测试设备及结果
（1）测试设备：Tecnai G2 Spirit冷冻透射电镜。
图6-31 DEC-205蛋白的负染样品在电子束照射下的形态特征（用上海设施Tecnai G2 Spirit冷冻透射电镜拍摄）
结合单颗粒重构技术，可以得到样品的三维形貌特征。
（2）测试结果：如图6-31所示，白色衬度显示为蛋白质样品，深色衬度为背景。蛋白质形貌清晰可辨。
（3）测试结论：在实验过程中，使用了分子量在130～180 kDa左右的蛋白质样品。运用负染方法能够清晰地拍摄到蛋白质样品的形貌特征。进而使用该方法可以将解析的分子量范围延伸至100 kDa左右。满足设计指标。
6.5.3 单颗粒三维重构能力(www.xing528.com)
验收指标是：完成1个或多个分辨率在0.8～1.2 nm，分子量为200 kDa以上的生物大分子复合物（如蛋白质分子机器、膜蛋白复合物或病毒等）的单颗粒三维重构。
6.5.3.1 肠道病毒EV71冷冻电镜单颗粒三维重构测试
1.测试方法：单颗粒重构与冷冻透射电镜观察
（1）类病毒样样品：肠道病毒71（enterovirus71，EV71），分子量达到5 MDa。
（2）电镜快速冷冻样品制备：参见6.5.1.2的“2.快速冷冻样品制备”（295—296页）。
（3）冷冻电镜观察：设备参数与设置为：加速电压300 kV；使用低电子剂量模式来控制样品曝光的时间和总电子剂量；使用欠焦值为1～2μm；Falcon相机像素合并为1，曝光时间为1 s。放大倍数为69 000倍左右。收集数据时，选择最佳区域，确保每张照片上大约显示50个病毒样单颗粒。
（4）单颗粒重构：运用EMAN软件，挑选电镜照片中的颗粒，通过参数输入与计算机运算，重构出样品结构，并得到相应的分辨率信息。
2.测试设备及结果
（1）测试设备：Titan Krios冷冻透射电镜。
（2）测试结果：如图6-32所示，经过EMAN软件处理和计算之后的EV71类病毒样样品的形貌特征，可以清晰辨认为球形颗粒状。重构后得到的分辨率如图6-33所示，为1.145 nm。
图6-32 单颗粒重构结果（彩图见图版第23页）
（a）EV71病毒的三维重构结果，为球形颗粒状；（b）类病毒样样品EV71的重构结果与EV71原壳体晶体结构的比对结果。
图6-33 EV71样品重构后的分辨率
这里分辨率取值依据傅里叶壳相关曲线（Fourier shell correlation，FSC）为0.5的标准。1Å＝0.1 nm。
6.5.3.2 鲍鱼血蓝蛋白Ht H1冷冻电镜单颗粒三维重构测试
1.测试方法：单颗粒重构与冷冻透射电镜观察
（1）超大分子复合物样品：鲍鱼血蓝蛋白Ht H1，分子量为8 MDa，D5对称性。
（2）电镜快速冷冻样品制备：参见6.5.1.2的“2.快速冷冻样品制备”（295—296页）。
（3）冷冻电镜观察：设备参数与设置：加速电压300 kV；使用低电子剂量模式，使用欠焦值为1～3μm；Falcon相机像素合并为1，曝光时间为1 s。放大倍数为47 000倍（0.142 nm／像素）。收集数据时，选择最佳区域，确保每张照片上大约显示30个单颗粒。
（4）单颗粒重构：综合运用EMAN1及EMAN2单颗粒重组软件包，共挑选电镜照片中的3 600个颗粒，通过参数输入并应用电镜系统的图形界面化工作站，进行三维重构运算，重构出样品的低温电镜三维结构。
2.测试设备及结果
（1）测试设备：Titan Krios冷冻透射电镜。
（2）测试结果：如图6-34所示，图为最终经过EMAN1软件处理和计算之后的Ht H1样品的形貌特征，从中可以清晰辨认呈圆桶状。重构后螺旋（helix）的棒状结构清晰可见，此为解析水平达到亚纳米（＜1 nm）量级的判断标准。根据此二级结构特征判断，分辨率在0.8～0.9 nm（图6-34c）。
图6-34 HtH1样品冷冻电镜三维重构后的结构（彩图见图版第24页）
（a）为俯视图。（b）为侧视图，其中一个非对称性结构单元中置入了相应的同源类似物原子模型[蛋白质银行识别号（PDB ID）：4 bed]。（c）为其中一个亚基结构细节的放大图。
3.测试结论
运用病毒样品EV71以及超大分子复合物Ht H1进行实验，经过单颗粒重构后得到分辨率为1.145 nm以及大约0.8～0.9 nm，满足设计要求。
6.5.4 生物大分子三维重构能力的测试结论
①样品为脂质体双层膜，采用电子断层三维重构，可清晰看到双层膜结构，分辨率达到2～10 nm。满足设计要求。
②利用负染方法，可清晰拍摄分子量在130～180 kDa之间的蛋白质样品。可进一步将解析分子量延伸至100 kDa，以满足设计要求。
③运用病毒样品EV71与超大分子复合物Ht H1进行实验，经过单颗粒重构后所得到的分辨率结果满足设计要求。
④每季度能测定20个三维结构，分辨率在1 nm或更高的达到2个。在样品本身的浓度与状态满足电镜数据收集的条件下，从测试过程中数据收集的时间判断，解析容量满足设计指标。
6.5.5 测试专家意见
对上海设施集成化电镜分析系统各项指标的测试表明：系统各项指标均达到工艺验收指标要求，并可以得出以下结论。
①系统具备对生物大分子复合物、膜蛋白复合物、蛋白质分子机器、病毒（分子量为200 kDa以上）等，以及对细胞、细胞器等大尺度三维结构的解析能力。
②对单颗粒三维重构的分辨率达到0.8～1.2 nm。
③对大分子复合物的电子断层三维重构的分辨率达到2～10 nm。
④可解析的分子量范围进一步延伸至100 kDa。
⑤利用冷冻电镜，每年具备解析至少80个分子量为200 kDa以上的生物大分子复合物、膜蛋白复合物、病毒和细胞器等的空间结构的能力，其中分辨率在1 nm或更高的有6～8个或更多。
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