透射电镜样品的基本制备技术实现

光学显微镜利用试样表面对光的反射能力差异，而产生衬度；透射电镜则利用样品对入射电子的散射能力差异，而形成衬度。这不仅要求制备出的样品保证电子的穿透能力，还要求样品保持高分辨率和不失真。因此，本章主要针对各种生物样品，介绍各种电镜生物样品的制备技术。

6.3.1　常规样品的制备及超薄切片技术

在进行生物样品的超微结构研究时，常规透射电镜的生物样品制备技术是最基本也最重要的方法之一。一般常规透射电镜电子束的穿透能力较弱，故而样品的厚度不能太大。透射电镜的分辨率很高，可以观察到样品上几乎所有细微结构；在样品处理过程的任何一个环节上出现问题，都可以导致样品的超微结构失真。因此，对样品制备过程的各个环节，都要加以精心把握。

6.3.1.1　主要使用的仪器和试剂

①多聚甲醛、戊二醛、四氧化锇（OsO4）、醋酸铀、柠檬酸铅；

②乙醇、丙酮、812树脂；

③切片机及切片机配件、修块机；

④镊子、离心管、睫毛笔、滤纸。

6.3.1.2　制样方法

1.取材

取材的方法是，将从实验动物中取出的组织，迅速放入预冷好的固定液中，使用刀片切去被镊子夹到和剪刀剪过的组织（避免机械损伤）。将组织切成0.5～1 mm3的立方体，或者横截面积为1 mm2以内的长方体。将切好的组织块转移到装有固定液的小瓶中，置于4℃的冰箱里（可保存数周）。

2.固定

固定的目的是在分子水平上，使被研究的组织和细胞，尽量保持接近其生理状态。常用的固定技术有化学固定法及物理固定法，前者更为普遍。化学固定是采用一定的化学试剂来达到固定的目的。它能够和细胞内的大分子物质发生交联，固定细胞内的蛋白质成分，也能保存糖类和脂类，保持细胞内成分的生理位置，从而达到把细胞的精细形态结构保存下来的目的。

不同的生物样品，其固定方法有所不同。细胞或者组织可以通过浸泡的方法来固定生物样品，大器官则往往通过灌注固定的方法。

（1）组织固定

固定组织的主要难点在于化学固定剂的低渗透性。条件允许的话，可使用灌注固定的方法。将固定剂注入动物的血管中，或直接灌注进分离的器官。使用刀片从灌注以后的样品，切下合适大小的组织块。

（2）浸透固定

当灌注条件不允许时，可以通过浸透的方法，快速固定小组织块。将取下的组织块放进盛有1 ml的0.1%戊二醛固定液的离心管中。将离心管放进真空箱中30 min，真空保持在760 Torr。组织块在戊二醛溶液中固定4 h以上，用0.1%PBS溶液漂洗5次，每次15 min。

（3）细胞固定

对培养细胞进行电镜观察时须固定。细胞固定的方法比较多，具体可参见文献[3]。

3.四氧化锇固定

向漂洗过的组织中加入0.5 ml的0.1% OsO 4固定液，避光，4℃，2 h。用PBS缓冲溶液漂洗2次，每次10 min。

4.脱水

（1）酒精梯度脱水

用浓度梯度为30%、50%、70%、90%的酒精，依次脱水，每次10 min。对神经、血管可以延长脱水时间到30 min。

（2）丙酮脱水

用浓度梯度为90%、100%的丙酮进行脱水，每次10 min。

5.浸透和包埋

（1）包埋剂的配制

Epon 812树脂的配方，一般沿用了H.Luft在1961年提出的配方。冬季和夏季的配方比例不同。以夏季配方为例，配制10 ml的包埋剂，成分比例为：6.2 g Epon 812、4.5 g MNA、1.4 g DDSA。待其充分混匀后，逐渐滴加0.15 ml的DMP-30^[3]，再搅拌10 min（根据包埋剂的量，适当延长时间）。

（2）浸透

包埋剂和无水丙酮按一定的比例混合均匀，逐渐渗入组织块中。无水丙酮与包埋剂按1﹕1混合后浸透组织块，放在摇床上振荡，浸透1 h，也可延长到3～4 h。然后加入纯的包埋剂，使得无水丙酮与包埋剂的比例为1﹕2，充分混合，摇床过夜。

（3）包埋

将在65℃干燥箱内烘烤后的空心胶囊或者一些其他的包埋管取出，先滴加一滴包埋剂，取出组织块放进胶囊内的包埋剂中，保证组织块位于胶囊的底部中央位置。然后加入足量的包埋剂。

（4）聚合

将包埋好的组织块放入37℃烤箱中24 h，然后将其转移到65℃的恒温箱中聚合48 h。

6.切片

（1）修块

一般用手工对包埋块进行修整。对于组织块较大的样品，可使用修块机进行修块。将包埋块夹在特制的夹持器上，用锋利的单面刀片先削去顶端和组织周围多余的包埋介质，使之呈金字塔形（图6-14）。

图6-14　样品切割示意图

（2）定位

对需要观察取材样品特殊部位的样品，在进行超薄切片前先定位。切出厚度为1～2μm的半薄切片。将切片转移到滴有蒸馏水的干净载玻片上，在60～80℃下展平烤干，用香柏油封片，使用相差显微镜进行观察和定位。寻找目标区域，把表面修成梯形或长方形，把观察部位保持在梯形或长方形的中央。梯形的底边一般为0.5 mm，高为0.3 mm左右。

7.带支持膜的载网的制备

关于超薄切片的载网，选用带有网孔的铜网。网孔越大，观察的有效面积也越大，但对切片的支持稳定性较差。覆盖支持膜的铜网，对于脆弱的切片具有重要的保护作用。理想的支持膜须厚薄适中，具有一定的强度。支持膜的制样方法有许多种，下面介绍一种常用的方法。

①使用2%的醋酸清洗100目铜网，蒸馏水清洗多次，丙酮清洗3次，置于通风橱中晾干。

②无水酒精清洗载玻片，用擦镜纸擦干。

③在载玻片上滴入一滴2%的formvar膜^[4]-氯仿溶液，保证载玻片上formvar膜的厚度。

④载玻片垂直晾干，通常在1～2 min会晾干。

⑤用刀片将载玻片的四边划开，保证formvar膜能从载玻片上分离。

⑥以45°角将载玻片缓慢地插入干净的蒸馏水中，formvar膜会从载玻片上分离开，漂浮在水面。

⑦检查formvar膜的完整性及光洁程度。根据膜的颜色检测厚度，银灰色的膜厚度较为合适。

⑧将干净的铜网放在漂浮的膜之上，让铜网的光滑面向上，粗糙面朝向formvar膜。

⑨取出铜网晾干。

8.超薄切片

①将修块定位好的组织块，固定在切片机上，保持样品梯形的下底在下面，固定钻石刀与刀架的间隙角为6°。

②打开切片机顶灯，让钻石刀慢慢地靠近样品。关闭顶灯，打开底灯，在显微镜下可以看到样品和钻石刀，样品上出现钻石刀的反光面。

③调整样品的角度，保证样品梯形的下底面与钻石刀平行。缓慢地移动钻石刀，使之靠近样品，直至在样品表面可以看到钻石刀的反光，并根据反光控制样品与刀之间的距离，以及钻石刀与样品之间是否平行，设定切割窗口，将钻石刀移动靠近样品，直至样品表面的反光消失（图6-14）。

④设定切割条件。设定切割的速度、样品的厚度。常规样品的厚度一般在80～100 nm之间（切割参数如图6-15的右边主图所示，其中左栏数值为速度，单位mm／s，右栏数值为样品厚度，单位nm）。在钻石刀的水槽中加入无离子水，保证水槽上可以形成银色反光面。

图6-15　超薄切片机的控制面板（彩图见图版第21页）

Memory：记忆；STO：存储；SPEED：速度；FEED：切片厚度；START：开始；END：结束；RESET：重设；HELP：帮助；MENU：菜单；Approach：钻石刀靠近；Counter：计数器；CLEAR：清除；MODE：模式；FC Mount：FC挂载。

⑤点击Start／Stop（开始／停止）按钮，开始切片，使用睫毛笔控制切片。在正常的切割条件下，可以在水槽表面看到样品条带。

⑥条带足够长的时候，停止切片。将亲水化后的铜网插入水中，慢慢移动到条带的下面，将条带转移到铜网上，使用睫毛笔控制条带（保证铜网上的样品条带不重叠）。

⑦将捞片后的铜网放在滤纸上，保证水分被吸干，放入培养皿中保存。切片完成。

图6-16　人工合成病毒衣壳的负染电镜图片（用上海设施的Tecnai G2 Spirit冷冻透射电镜拍摄）

6.3.2　负染色技术

负染又称阴性反差染色。它是利用高密度且在透射电镜下显示结构的重金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生物样本包围起来，在黑暗的背景中呈现出阴性反差样品的细微结构。样品结构呈透明浅色，背景为无结构的黑色或者灰色（图6-16）。负染技术是在1959年首先由S.Brenner和R.W.Horne等人采用的，在后来的生物学研究中得到广泛应用。负染不需要经过固定、脱水、包埋和超薄切片等复杂操作，而是直接对沉降的样品匀浆悬浮液进行染色。现在这项技术广泛应用于病毒、蛋白质分子、生物大分子结构、纤维、亚细胞膜碎片、脂质体和人工膜、合成DNA序列以及聚合物溶液和各种纳米样品的检测。负染方法为今天病毒学的诊断作出了重要贡献，可以用来快速评价样品的纯度、样品的分离及聚合状态、蛋白质的尺寸，以及样品缓冲液的pH等状态对样品的影响。

负染样品所需要的支持膜为连续碳膜。碳支持膜的制样方法一直在不断改进中。1968年R.Valentine及其同事使用了一种新的制样方法。他们发现，碳膜可以从云母上释放出来，直接漂浮在生物样品液滴的表面。样品可以吸附到碳膜上，而碳膜被转移到铜网上进行清洗和染色。后来又在此方法基础上，发展出不同的制样方法。

染液一般由重金属盐配制，最常用的有磷钨酸、磷钨酸钾、磷钨酸钠^[5]、醋酸铀、甲酸铀和钼酸铵[（NH 4）2 Mo O 4]等。染色的方法包括悬滴法、喷雾法以及漂浮法。本节主要对负染方法的步骤作简单介绍。

6.3.2.1　仪器

（1）根据制样顺序使用的仪器有真空镀膜仪、辉光放电仪和红外灯烘烤仪。真空镀膜仪可以控制碳膜的厚度。碳棒、碳纤维或者碳电子源用来制备连续碳膜、碳塑料膜或者有孔碳膜。30～60 s的亲水化处理，对于解决支持膜的天然疏水性问题具有重要的作用，可保证样品溶液和染液形成均匀厚度的液体薄膜。使用红外灯烘烤连续碳膜10 min左右，以减少水分对生物样品检测的影响。

（2）实验中使用的耗材包括封口膜、反向镊、直镊、移液枪、剪刀、滤纸、培养皿、云母、300或400目铜网、离心管。

6.3.2.2 负染操作方法

1.支持膜

尽管电镜耗材供应公司所供应的不同类型支持膜的铜网，可以满足大部分材料和生物样品的制样要求，但是制备合适的碳支持膜的铜网，依然是电镜制样中的一种重要技术。

碳支持膜的制备是这样的：在真空条件下，让碳沉积在干净的云母上，然后使碳膜漂浮在无离子水的表面，并沉积在电镜铜网之上。碳膜的厚度在10 nm左右[4]。

碳塑膜的种类较多，主要包括火胶棉（collodion）、方华膜（formvar）、聚乙烯醇缩丁醛（butvar）和聚乙烯醇缩醛（pioloform）几种。将氯仿溶液（0.1%～0.5%）滴在一块洁净的玻璃片上并晾干，用锋利的刀片在玻璃片上划开，然后将玻璃片插入无离子水中，支持膜脱离玻璃片漂浮在水面上，将铜网放在漂浮的支持膜上。水面下降后干燥，即可真空喷碳（formvar膜的具体制备步骤可参考6.3.1小节中271页“7.带支持膜的载网的制备”）。

薄塑料膜增加了碳支持膜的力度，在免疫标记实验过程中具有重要的支撑作用，但是塑料支持膜影响图像的质量与分辨率，因此对于连续碳膜或者有孔碳膜，可使用氯仿或者丙酮，溶解铜网上的塑料支持膜。

图6-17　连续碳膜常规负染方法示意图

2.连续碳膜的常规负染方法

①剪取一定量的封口膜，长度依照样品的数量而定，保证每个样品之间的间距为1.5 cm（图6-17）。

②将封口膜放在干净的工作台上，去除封口膜上面的纸，使用钝器在封口膜上画多条平行直线。

③分别取20μl样品悬浮液、蒸馏水（或者5 mmol／L缓冲液）、染盐溶液，液滴的数目依照样品的需要、清洗试剂的浓度而改变（连续清洗会引起碳支持膜的破损）。通常每一批样品不要多于6～8个铜网。

④用弯镊或者反镊取一个带有连续碳膜的铜网。对铜网先进行亲水化，增加碳膜表面的亲水性，保证样品和染盐在碳膜上均匀分散。将铜网放在样品液滴的表面（亲水化的铜网表面向下）。经过大约5～60 s，在铜网的边缘，用滤纸小心地吸干铜网上多余的样品溶液。

⑤在样品干燥之前，使用蒸馏水水滴清洗吸附的样品，仔细吸干铜网上多余的液体。

⑥将铜网放在染盐溶液的表面一定时间，然后吸干多余的溶液，在红外灯下烘烤一定时间，放到合适的容器中保存（不同染盐制备的样品，储存时间不一致），或者直接用于电镜检测。

3.漂浮负染方法

①取20～60μl样品溶液、漂洗液、固定液和染液，放在微孔版上，保持充足的照明。

②用剪刀剪去一小块铺有碳膜的云母，用镊子夹住一角。

③小心地将云母插入样品溶液中，碳膜漂浮在液滴表面，碳膜与云母不完全分开。样品吸附在碳膜之上，然后慢慢取出云母碳膜，恢复到云母的原始位置，用滤纸将云母上多余的液体吸干。

④以与③相同的步骤，将云母插入清洗液中（无离子水）。如果样品需要固定，可使用0.05%～0.01%的多聚甲醛来固定样品。

⑤使云母上的碳膜完全漂浮在染液之上。

⑥把无水酒精洗过的铜网，小心地插入漂浮碳膜的液滴之下，慢慢捞起铜网。用滤纸吸干铜网上多余的染液。

⑦把铜网放在红外灯下烘烤，样品干燥后可使用TEM进行观察。

图6-18　包裹着碳棒的脂质体的冷冻电镜图片（用上海设施的Tecnai G2 F20冷冻透射电镜拍摄）

6.3.3　快速冷冻制样技术

在低温条件下将样品固定在一层薄而透明的无定形冰（玻璃态冰）中，用电子显微镜进行成像观察，这种方法被称为“低温冷冻电镜技术”（cryo-electron microscopy，cryo-EM）。一方面，用冷冻电子显微镜技术所研究的生物样品，既可以是具有二维晶体结构的蛋白质，也可以是单颗粒；另一方面，生物样品通过快速冷冻的方法进行固定，可以使蛋白质和缓冲溶液迅速从溶液态转变为玻璃态，而玻璃态能够保持蛋白质的天然结构状态。如果以缓慢温和的冷冻速率去冷冻样品，则缓慢冷冻的过程会形成晶体冰，生物分子的结构将被晶格力彻底损坏。快速冷冻避免了常规的样品处理过程中由一系列操作对样品构象造成的假象，更加接近样品的生理状态。图6-18为使用本设施冷冻电镜所拍摄的冷冻脂质体样品。

“玻璃态冰”首先是由J.Dubochet及其同事于20世纪80年代在实验中发现的。为提高玻璃态冰的成功率，薄的蛋白质溶液必须以最快的速度冷却，才可以保证液体形成无定形、非结晶态的冰。这需要特殊的装置，将样品迅速插入冷冻保护剂中（乙烷、丙烷或两者的混合液体），保证冷却速度大于200 K／10-4 s。水由液体变成玻璃态，冷却速度为105～106 K／s。水的导热性能不好，冰的厚度必须小于3μm。目前市场上存在一些手动的或者半自动的仪器，可以实现生物样品的冷冻。目前常用的冷冻制样仪器有3种——Vitrobot（FEI公司）、EM GP（Leica公司）、Cryoplunge TM 3（Gatan公司）。仪器提供可控的温度和湿度设置，减少载网上液体的蒸发，提高冷冻制样的可重复性。

在制样过程中使用的标准载网为3 mm带孔支持膜的金属载网，常见的金属载网为铜网和金网，支持膜为碳膜和石墨烯。市场上的可用载网主要有：支持膜带有规则孔径的Quantifoil载网和C-flat载网；不规则孔径的Lacey carbon（蕾丝）载网。载网的种类以及孔径的大小，主要根据样品和实验条件来选择。

6.3.3.1　仪器及试剂

①Vitrobot自动冷冻制样仪、等离子清洗机。

②液氮、乙烷、丙酮。

③冷冻镊子、大镊子、铜网、杜瓦瓶、冷冻铜网储存盒。

6.3.3.2　实验方法

①检查自动冷冻制样仪中的无离子水量，保证样品仓中的湿度。

②将乙醇或者丙酮清洗的铜网晾干后，辉光放电30 s（具体时间根据仪器设定）。

③开启自动冷冻制样仪，设置仪器的参数，包括样品仓的温度与湿度，滤纸吸附的时间、次数和力度、滤纸吸附前和吸附后的等待时间（如图6-19所示）。

图6-19　Vitrobot自动冷冻制样仪的面板参数（彩图见图版第22页）

Temperature：温度；Humidity：湿度；Off：关；On：开；Man：手动；Miscellaneous：其他；Start：开始；Stop：停止；Blot Time：吸附时间；Wait Time：等待时间；Drain Time：晾干时间；Blot Force：吸附力度；Blot Total：吸附次数；Skip Application：跳过应用。

图6-20　Vitrobot自动冷冻制样仪杯

④更换自动冷冻制样仪样品仓中的Whatman吸水滤纸（每次保证更换样品的时间）。

⑤将自动冷冻制样仪杯的配件摆好（如图6-20所示），液氮冷却自动冷冻制样仪杯。大约5 min之后，铜杯中没有液氮残留。小心打开乙烷阀门（乙烷／丙烷混合气体），将乙烷气体充入自动冷冻制样仪杯内的铜杯中，几分钟之后形成液体乙烷。慢慢将乙烷加满，注意维持乙烷的液体状态。

⑥使用自动冷冻制样仪镊子夹住铜网，保证铜网的平整性。将镊子装在自动冷冻制样仪上，弯曲的铜网会引起铜网上碳膜的破裂和铜网上样品厚度的不均一。

⑦将自动冷冻制样仪杯转移到自动冷冻制样仪上面，通过自动冷冻制样仪样品仓旁边的样品孔上样。上样量为1～5μl，确定铜网的上样面为辉光放电面。

⑧使用自动冷冻制样仪上面的脚踏板控制自动冷冻制样仪开始运行，减少每一步所消耗的时间。冷冻结束后，保证镊子在乙烷中冷却充分。

⑨小心地将铜网转移到储存盒中。在转移过程中，减少样品暴露在液氮之外的时间，避免结晶冰的污染。

⑩冷冻后的铜网可以直接使用冷冻电镜进行观察，或者放入50 ml离心管，再放入液氮罐中保存。

6.3.4　冷冻负染色技术

冷冻电镜和单颗粒重构技术是研究结构生物学的重要方法之一。负染方法可提供生物样品的分子形状和分布状态等信息，但是在理论上，负染并不能提供分子内部信息，比如究竟是α-螺旋还是β-折叠。生物样品的负染，主要利用生物分子与分子周围染盐对电子的散射能力不同，而冷冻方法利用的是生物分子与周围玻璃态冰的衬度不同。不过，常规负染需要在空气中进行干燥脱水，因此导致样品的一些结构发生变化。为保证样品在电镜中能保持含水状态，对负染后的样品不经过干燥就直接使用电镜观察，但由于电镜镜筒的真空环境导致水分子迅速挥发，故并不能保持样品的含水状态。

虽然冷冻方法能够保持样品的含水状态，避免脱水所引起的假象，但由于利用了生物分子与周围玻璃态冰衬度不同的原理，因此冷冻含水生物样品电镜图片中的信噪比较低。改善生物样品的信噪比，是获得高质量图片的重要方向之一。负染样品被冷冻到液氮中，并在电镜中保持液氮的温度，结合水就不会出现挥发的现象，这样就克服了负染和冷冻方法的不足之处。冷冻负染方法在保持样品含水的状态下，提高了生物样品的信噪比（如图6-21）。目前存在2种冷冻负染方法——M.Adrian方法和H.Stark方法。第一，Adrian冷冻负染方法与常规冷冻电镜制样的方法相似，可以保证样品在生理pH条件下的含水状态，但是溶液中存在饱和钼酸铵（图622）。第二，Stark方法建立在碳膜三明治（carbon-sandwich）方法之上，使用经典的醋酸铀或甲酸铀作为负染染料（图6-23）。冷冻负染方法与常规的负染方法相比，保持了样品的含水状态；与冷冻方法相比，则提高了信噪比。本小节主要对2种方法的具体步骤进行简要介绍。

图6-21　花叶病毒的冷冻负染照片[6]

图6-22　Adrian冷冻负染方法的示意图

虚线表示铜网，实线表示封口膜，铜网漂浮在染盐上10～60 s。（图片引自[5]）

图6-23　三明治方法的流程示意图（彩图见图版第22页）

图片引自[5]。

6.3.4.1　试剂和仪器

①四水合钼酸铵、无离子水、NaOH溶液、醋酸铀／甲酸铀溶液、碳膜。

②铜网、镊子、离心管、培养皿、封口膜、冷冻铜网储存盒。

③亲水化仪器、自动冷冻制样仪。

6.3.4.2　实验方法

1.Adrian方法

①在2 ml离心管中加入1.2 g四水合钼酸铵。

②加入0.875 g无离子水，振荡溶解。

③加入0.125 ml的10 mol／L NaOH溶液，振荡。溶液为饱和溶液，离心管中会存在未溶解的粉末。

④亲水化铜网（铜网可以为连续碳膜或者有孔碳膜）。

⑤在培养皿中放入方形的封口膜。在封口膜上滴上样品，将铜网放在样品液滴上，吸附10～30 s，用干净的培养皿盖住。

⑥在培养皿中的封口膜上加入80～100μl染盐溶液，将铜网放在染盐液体中（铜网吸附样品面向下，正对染盐）。

⑦铜网在染盐上吸附10～60 s后移走铜网。长时间的浸透有利于染盐的分布。

⑧尽快将铜网固定在自动冷冻制样仪，防止液体蒸发（快速冷冻制样的具体步骤参见275—277页“6.3.3 快速冷冻制样技术”）。

2.三明治方法

①将铺有碳膜的云母一端插入样品溶液中（如图6-22所示），不可使碳膜与云母完全分开。吸附一段时间后，将云母从样品溶液中取出，分离的碳膜重新吸附到云母表面。

②将吸附样品的云母放入甲酸铀染液中，云母完全与碳膜分开。

③将铜网放到漂浮的碳膜之上，使碳膜吸附在铜网上。取出铜网。

④将一块带有碳膜的云母放入染液之中，使碳膜漂浮在染液上。

⑤将带有样品的铜网放入上面漂浮在染液之上的碳膜上，从而使蛋白质颗粒包含在2层碳膜之间形成的“sandwiched”（三明治或夹层）结构中。(www.xing528.com)

⑥将铜网放置1～2 min后，快速冷冻制样（具体步骤参见6.3.3小节）。

6.3.5　聚焦离子束技术

聚焦离子束技术（focused ion beam，FIB）首先应用于半导体器件的线路检测。其原理是，将离子束（通常指稼离子束）会聚在很小的区域，通过溅射作用，使材料被高速的离子减薄。每一次离子的喷射，都会削减样品表面大约10 nm的厚度，从而引起样品表面厚度的降低，形成平行于离子束的表面结构。

FIB首先于1974年由R.L.Seliger和W.P.Fleming提出，他们可以将离子束聚焦在几微米的厚度。后来他们发明了镓离子（Ga3+）的离子扫描系统，可以聚焦到100 nm。FIB首先被用于检测半导体工业样品的瑕疵（如图6-24所示）。在1996年，T.Ishitani认为FIB技术可应用于生物样品的制样过程中，而现在已应用于冷冻生物样品的处理过程中。这种方法可以减少样品中假象的出现（切割引起的褶皱或者刀痕），使样品保持在玻璃态。目前FIB是唯一一种可以切割冷冻样品而且不会引起样品压缩的方法。与切割刀方法相比，用FIB方法切割的样品更加光滑；即使含有一定量冰晶的样品，也可以被切割出理想的厚度。FIB的缺点是，强离子束会造成试样损失；Ga3+轰击时，也会残留在试样中。

图6-24　聚焦离子束切割示意图

6.3.6　高压冷冻+冷冻替代

冷冻固定是目前保存生物样品或者柔软的浓缩材料的最好方法。冷冻样品没有化学固定和重金属染色的假象，可以很好地保证细胞或者组织的生理状态。但是在常压、没有抗冻剂的作用下，冷冻样品厚度超过几微米就会产生大量冰晶，损坏样品结构。而在高压和冷冻保护剂的作用下，一些样品的冷冻厚度可以符合要求。高压冷冻（highpressure freezing，HPF）的发展克服了以上缺陷，可以在保持样品生态结构的基础上，使冷冻的厚度达到200μm。生物样品在几毫秒的时间之内，在2 100 bar的压力下迅速冷冻，防止高压引起生物样品结构的改变。HPF可以解决许多常规制样如化学固定所不能解决的问题，是生物结构学研究中的重要工具。

目前存在4种不同的HPF仪器——EM HPF100、EM PACT2（Leica）、HPM010和HPF Compact 02。EM HPF100、HPM010和HPF Compact 02的主要原理是，液氮在高压下对包含样品的样品仓进行加压和冷冻。在室温下加入一定量的乙醇，调整压力的增加和冷冻的过程。EM PACT2系统主要在传送液（甲基环乙烷）的作用下，对样品仓中的样品进行加压，然后在10 bar的压力下进行冷却。对高压冷冻后的样品根据不同的生物样品，使用不同的处理方法。这里主要就高压冷冻的使用以及后期样品的处理进行介绍。

6.3.6.1　仪器

（1）高压冷冻仪（Wohlwend HPF Compact 02）、自动冷冻替代仪（Leica AFS2）、等离子清洗机（plasma cleaner）、50 ml离心管、2 ml冷冻管、镊子、滤纸、HPF样品铝盘A（0.1 mm／0.2 mm）和B（0.3 mm）。

（2）铜网：Quantifoil铜网R2／1（EMS公司）、lacey carbon铜网（Ted Pella公司）、C-flat铜网（EMS公司）、铜网储存盒。

（3）液氮、乙醇、锇酸、醋酸铀、柠檬酸铅、丙酮。

（4）1%OsO4-0.1%醋酸铀-丙酮固定液

①5%醋酸铀-甲醇溶液：0.1 g的醋酸铀加入2 ml离心管中，加入2 ml预冷的甲醇，涡旋至完全溶解。

②加入24.5 ml的丙酮溶液到50 ml的离心管中，冰上预冷。

③取0.2～0.3 ml的丙酮，溶解安培瓶中0.25 g的OsO4，将溶液转移到50 ml离心管中。

④加入0.5 ml 5%醋酸铀到50 ml的离心管中，混合均匀。

⑤把1%OsO4和0.1%醋酸铀丙酮，分装到2 ml冷冻管中，迅速放到液氮中冷冻储存。

⑥70%甲醇配置3%的醋酸铀溶液：加入15 ml双蒸水^[6]和35 ml甲醇到50 ml离心管中预冷。称量1.5 g醋酸铀，加入离心管中，在4℃下溶解，用0.2μm孔径过滤，以封口膜封口保存。

（5）制备Sato铅溶液

①0.2 g无水柠檬酸铅、0.15 g硝酸铅[Pb（NO 3）2]、0.15 g醋酸铅、1 g柠檬酸钠。

②称量4种试剂加入50 ml离心管中，再加入41 ml无离子水，混合均匀。加入9 ml 1.485 mol／L的NaOH，直至溶液澄清。用0.2μm滤器快速过滤溶液，以封口膜封口保存。

6.3.6.2　高压冷冻方法

①开启高压冷冻仪，仪器开始冷却，样品泡沫盒中装满液氮。

②提前使用丙酮清洗样品铝盘，在空气中晾干，放到1-十六碳烯中保存。

③取出样品铝盘，滤纸吸干多余的1-十六碳烯，表面留存一层1-十六碳烯液体。

④将细胞或者组织，快速转移到HPF样品铝盘（carrier）中，保持样品的生理条件（温度、湿度、浓度、时间），保证样品和铝盘表面有充分的接触。

⑤在铝盘中加入填充液体（1-十六碳烯）。

⑥从1-十六碳烯中取出另一个铝盘盖上，注意不要有气泡。用滤纸吸取铝盘周围多余的液体（如图6-25所示）。

⑦在高压冷冻仪中冷冻样品，保证冷冻的时间和速率。

⑧把样品迅速转移到装满液氮的泡沫盒，取下样品放入冷冻替代液中，然后在液氮中旋紧盖子，在储存管中储存，避免冰的污染。

⑨关闭仪器。

图6-25　铝盘侧面示意图

6.3.6.3　冷冻替代固定

①开启Leica AFS2冷冻替代器，保证替代仓干燥。在替代仓中加入50 ml的乙醇，盖上盖子。

②加入约38 L液氮到冷冻替代器中，开始冷却仪器。

③设置冷冻替代器的参数如表6-2所示（不同样品的冷冻替代参数有所不同）。

表6-2　冷冻替代时间表

④开启程序使仪器温度下降到-90℃，然后按Pause（暂停）键。

⑤用预冷的镊子将存放样品的替代管转移到AFS2替代仓中。

⑥盖上盖子，按Resume（继续）键开始程序。

⑦对替代后的样品进行常规的树脂包埋（包埋方法见269—272页“6.3.1 常规样品的制备及超薄切片技术”）。

6.3.7　冷冻切片技术

对于细胞组织的常规电镜方法，包含室温下的化学固定、脱水、树脂包埋等步骤，容易引起细胞成分的聚集以及由抽提造成的结构改变。而使用冷冻电镜，可以避免这些因素。冷冻样品不需要固定和染色，可以很好地保证含水细胞或者组织的生理状态。最近几十年，冷冻样品处理方法和电镜技术的进步，促进了结构生物学的发展。电镜成像对于组织的厚度提出了较高要求，而目前只有较少生物样品（小细菌和小细胞）可以在冷冻电镜中直接成像，而大部分生物样品（大细菌和大部分真核生物）的厚度超出500 nm，完全超出了电子束的穿透能力。即使采用电子断层扫描方法，也不能解决上面这个难题。随着样品的倾斜，样品的厚度逐渐增加，电子束的穿透能力降低。冷冻切片可以减少样品的厚度，切割后的样品可以在冷冻电镜下观察。

冷冻电镜的限制在于，生物样品在缺失包埋剂和固定剂保护的条件下，更加容易受到电子束的损伤。锇酸和重金属染色的缺失，导致样品的对比度及信噪比降低，并且在冷冻切片过程中容易产生冷冻机械力假象，诸如切片的压缩、刀痕和裂缝等。冷冻切片太薄的话，容易产生褶皱，而厚度增加又容易导致切片断裂。玻璃态样品的切割，是一项具有挑战性的工作，也是一件耗时较多的事情。本小节主要对冷冻切片的步骤作简单介绍。

6.3.7.1　仪器和试剂

①配备FC7冷冻仓的UC7冷冻切片机、静电发生器。

②刀刃倾斜35°的冷冻切片钻石刀、刀刃倾斜45°的冷冻修块钻石刀。

③睫毛笔、镊子、Leica冷冻工具、冷冻样品储存盒、冷冻铜网、冷冻胶（乙醇和异丙醇以1﹕3混合）、PBS稀释的葡聚糖。

④样本即是被高压冷冻固定在铜管或者金管中的单细胞，组织可使用铝盘加以冷冻。

6.3.7.2　方法

1.开启冷冻切片机

①给冷冻切片机的杜瓦瓶中加满液氮。缓慢地将泵插入杜瓦瓶中，将泵和软管连接起来，冷冻仓预冷刀至-140℃。

②将样品固定器插到切片机臂上，固定好螺丝。

③将刀架放入冷冻仓中，在刀架的左边位置放入修块刀并固定好。

④将刀座固定在冷冻仓最后的位置，给固定样品留出足够的空间。在上样之前，所有工具必须冷却到-140℃，防止样品重结晶化。

2.固定样品

①铜管：将铜管插入样品夹中，用工具将铜管固定在样品架上。

②金管：金管需要固定在冷冻好的样品钉上，首先切去金管闭合的一端，使用冷冻胶将金管固定在样品钉上。

③组织块：小心地取出冷冻好的组织块，使用冷冻胶将样品固定在预冷的样品钉上。

6.3.7.3　修块

好的修块有利于切出质量较高的冷冻切片，而修块的目的是修出一个平顶金字塔（如271页图6-14）。铜管或者金管都采用质地松软的金属材料，可以直接使用钻石刀进行修块。为避免金属中杂质对钻石刀的影响，可以分别使用2把刀来切割金属块和样品。

①设定样品杆的位置为0°，样品杆上有360°刻度，可以准确地旋转90°。

②样品刀的角度可使用冷冻仓前面的滚轮加以控制。在中间位置可以锁住滚轮，推荐从这个位置开始修块。

③设置静电发生器到最大功率，以清除刀背上不需要的样品切片。

④使用切片机底灯，观察样品和刀之间的距离，可以有较好的视野。

⑤设定修块的最大速度为100 mm／s，正常的切片厚度为50～500 nm。切片厚度大于500 nm会损害钻石刀。

⑥继续修块，直至样品表面光滑。样品中玻璃态冰的表面通常为黑色反光，样品的表面为白色反光。

⑦移动修块刀到左边，平行于样品表面，以样品的左边缘作为起始点。

⑧修块20～30μm后，后退样品刀，右移至样品的右边，切割梯形的另一边。突出的样品的厚度不要超过100μm。

⑨松开样品杆，旋转90°，按同样的步骤切割梯形的第三边和第四边。

6.3.7.4　切片

要获得好的冷冻含水样品，需要许多条件，涉及样品的性质、刀的性质。在切片过程中产生的静电荷，可致使切片黏附在刀的边缘。通过使用静电发生器，可以清除样品表面的静电荷。另外，环境因素对于样品亦有重要的影响。最重要的是控制房间的温度与湿度。高湿度可引起样品表面结晶冰的形成。电子束并不能穿透样品表面的结晶冰，这就导致样品信息的丢失。另外，湿度也会影响静电发生器的功能。温度应该控制在20℃，湿度要低于30%。

①固定钻石刀。将钻石刀放入刀架，移动样品杆到最上面，确保样品不会碰到钻石刀。旋转刀架90°，确保钻石刀表面正对样品。如果需要的话，可将刀架间隙角设置为6°。固定钻石刀。

②将冷冻工具台固定在刀架上。冷冻工具台由一个压制系统和一个固定铜网的镊子组成。压制系统由2片相对的金属片组成，表面具有光滑的陶瓷，可用来夹住铜网，使之靠近钻石刀。

③固定铜网。使用铜网固定器，固定一个铜网。铜网冷却以后，慢慢移动铜网，使之靠近钻石刀。

④移动钻石刀。打开底灯，慢慢地移动钻石刀靠近样品，直至在样品表面可以看到钻石刀的反光，根据反光控制样品和刀之间的距离，以及钻石刀和样品之间是否平行。设定切割窗口，将钻石刀靠近样品，直至样品表面反光消失。

⑤设定切割条件。设定切割的速度、样品的厚度以及静电发生器的强度。控制面板上的设置，以及静电发生器距离钻石刀的距离，决定了静电发生器的强度。电荷较多则切片被吹飞，电荷太少则样品黏附在刀面上。

⑥切片和转移样品。开始自动切片，使用睫毛笔控制切片。在良好的切割条件下，可以切出条带。将条带转移到铜网上，当条带足够长时，停止切片，关闭静电发生器。

⑦使用压制系统将切片黏附在铜网上。切片被转移到铜网之上，移动铜网夹到最后面，放下压制系统的下面部分。将铜网放在陶瓷面上，合上压制系统的上面。

⑧把铜网转移到冷冻铜网储存盒中。打开冷冻铜网储存盒，使用预冷的镊子，将压制系统里面的铜网，转移到冷冻铜网储存盒中。关闭冷冻铜网储存盒，防止结晶冰的污染。对样品可以直接使用冷冻电镜进行观察。

6.3.8　免疫电镜技术

生物样品的电镜检测，需要通过切片来获得保护细胞内部结构的足够薄的切片。制备足够薄的生物组织切片，一直是生物学家追求的目标。随着常规制样方法的不断提升，生物样品的精细结构可得到更好保存。但是，生物样品检测方法的改进，并不完全符合免疫标记的制样要求。在常规制样方法不断改进的过程中，有些实验室已经开始进行冷冻切片的研究。使用蔗糖作为保护剂，用钻石刀进行切片，通过蔗糖液滴把样品转移到formvar膜铜网上，进行免疫标记。

醛固定后含水生物样品的冷冻超薄切片，保证了免疫标记的效率。但是，没有包埋剂的生物样品，在切片过程中会引起抗原的丢失和位置的移动。多种材料可以保护生物样品的超微结构。在使用蔗糖作为保护剂的生物材料中，可以通过改变温度来控制样品的硬度。

胶体金颗粒的使用，增加了切片的对比度和靶蛋白定位的准确性。而不同尺寸的胶体金，促进了多标记实验的发展。

在最初的研究中，使用蔗糖液滴将冷冻切片转移到铜网之上。但是通过后来的实验发现，蔗糖的表面张力会损害切片的超微结构。而在蔗糖中增加甲基纤维素，可以减小蔗糖的表面张力，从而起到改善样品超微结构的作用。

电镜的免疫化学标记，是定位细胞内蛋白质分布和丰度的一种重要方法。要在没有毁坏和抽提蛋白质结构的基础上得到细胞内信息，需要特殊的制样方法。而化学固定后的冷冻切片和冷冻固定后的冷冻切片，为免疫电镜提供了重要的支持。本小节将对免疫标记的具体流程进行简单介绍与总结。

6.3.8.1　材料和仪器

（1）镊子、杜瓦瓶、睫毛笔、loop^[7]、冷冻铜网、formvar膜铜网、冷冻铜网储存盒。

（2）液氮、蔗糖溶液、电镜样品载网（100目）、干净的25 mm×75 mm的载玻片、2%和4%的formvar膜溶液、200 ml玻璃锥形烧瓶、2%含水醋酸、纯乙醇。

（3）冷冻切片机（Leica公司）、抗静电装置（Leica公司）、镀膜仪、冷冻修块刀（刀刃倾斜角度为20°）、冷冻切片刀（刀刃倾斜角度为25°）。

（4）样品的制备

①4%多聚甲醛和0.1%戊二醛溶液，溶解于100 mmol／L的PBS中（pH 7.2）。

②PBS配置2.3 mol／L蔗糖溶液。

③手术刀片、薄剃须刀片。

④液氮、杜瓦瓶。

（5）免疫标记

①PBS、小牛血清（fetal cow serum，FCS，10%）、一抗、二抗^[8]。

②胶体金、1%戊二醛溶液、0.12%甘氨酸溶液。

③封口膜。

6.3.8.2　实验步骤

（1）formvar膜铜网的制备（参考271页“7.带支持膜载网的制备”）。

（2）化学固定样品（参考269—270页“2.固定”和“3.四氧化锇固定”）。

（3）样品的冷冻

①将组织块或者细胞块转移到1 ml 2.3 mol／L蔗糖溶液中，盖好盖子，在4℃下振荡，固定过夜。

②将浸透的组织块取出，放到干净的样品钉上，滤纸吸干多余的蔗糖。利用蔗糖将样品粘在样品钉上。用液氮冷冻样品。

（4）冷却超薄切片机和冷冻刀

①给冷冻超薄切片机的杜瓦瓶加液氮。缓慢地将液氮泵入杜瓦瓶中，以冷却装置。

②选择切片机刀架，固定刀架。

③把修块刀和钻石切片刀固定到刀架上，间隙角为6℃。

④设定切片机的温度到-150℃（样品仓、钻石刀和样品），然后开始冷冻。

（5）样品转移到冷冻样品仓

①将超薄切片机冷冻到-150℃以后，将钻石刀等工具放入冷冻仓，提前预冷。

②快速将样品从液氮中转移到预冷的样品仓中，用蔗糖将组织块固定到样品钉上。

③把样品钉固定到样品台上。

（6）修块

①缓慢地使刀架靠近样品表面。

②让抗静电装置靠近刀背，在修块模式下使用最大功率。

③设置切片窗口，切割速度最大为100 mm／s，切片厚度500 nm。

④修平包埋块前段，直至包埋块表面平滑有光泽。

⑤后撤修块刀，移动修块刀至样品右边，靠近包埋块，将包埋块右边切至光滑。以同样的步骤将左边包埋块修至光滑，保证样品有1 mm×2 mm的面积。

⑥样品顺时针旋转90°，将左侧修至光滑，并以同样步骤将右侧修至光滑。

⑦样品逆时针旋转90°，将样品旋转至原始位置。用预冷的钻石刀取代修块刀的位置。

（7）切片

①旋转刀架切换成切片刀，保持温度稳定。

②小心地将钻石刀移动到样品的边缘，设定切割窗口。样品的下边缘为切割开始的位置，样品的上边缘为结束的位置。

③设定抗静电为50%或者更少，样品的切割厚度为80 nm，设定切割的速度在0.6 mm／s和2 mm／s之间。

④使用切片机控制面板上的前进键滚轮移动样品块，小心控制刀和样品之间的距离，并根据刀和样品之间的位置，调整样品的角度。然后，用精调按钮来控制样品和刀之间的距离，直至样品表面的碎屑碰到钻石刀。

⑤开始切片。在良好的环境下，可以切出理想的条带。

（8）转移切片

①出现切片的时候，使用预冷的睫毛笔，将切片转移到铜网之上。

②对于后期用来免疫标记的铜网，使用loop捞起一滴甲基纤维素／蔗糖混合液。将loop转移到冷冻仓中，使用冷冻的液滴粘取切片。将带有切片的液滴滴在formvar膜铜网上，以备后期的免疫标记。

（9）切片的储存

①切片转移到铜网上，可以储存在2%的明胶之上。明胶在4℃时凝固。在用于免疫标记之前，将凝胶加热到37℃，取走铜网。铜网必须储存在潮湿的环境中，防止切片脱水影响样品的结构。

②如果制备好的铜网需要长期储存，可将切片黏附在载玻片上。使用2.3 mol／L蔗糖和2%甲基纤维素（1﹕1），将切片转移到铜网上，最后将整个载玻片放入4℃密闭的培养皿中保存。切片周围的甲基纤维素和蔗糖溶液将会脱水干燥，并不会影响切片的超微结构。

（10）切片的免疫标记

①取适量大小的封口膜，在封口膜上滴上500μl的0.12%甘氨酸溶液。将铜网黏附切片的一面向下，盖在甘氨酸溶液上5 min。

②将铜网转移到10%小牛血清（FCS）溶液中，为时5 min。

③将铜网转移到10%PBS稀释的兔抗体中。用一张湿滤纸盖住抗体溶液，保持抗体周围的湿度，防止抗体的挥发。保持20 min。

④将铜网放入500μl的PBS溶液中，清洗5次，3 min／次。

⑤将铜网转移到5μl结合金颗粒的抗体溶液中，盖上培养皿，保持环境湿度。

⑥用PBS清洗铜网5次，4 min／次。

⑦转移铜网到1%多聚甲醛，保留5 min。用PBS清洗，1 min／次。

⑧水洗4遍，每次1 min，可以减少铜网上的盐沉淀。

（11）增加对比度和干燥样品

①将2%的甲基纤维素和3%的醋酸铀溶液混合均匀，配成0.3%的醋酸铀溶液。混合之后立刻使用，始终把溶液保持在冰上。

②将混合溶液滴在冰块上面的封口膜上，将铜网覆盖在液体之上10 min。用无离子水清洗铜网。

③使用loop将铜网从溶液中移出，用滤纸吸干多余的溶液。

④把铜网放在loop上干燥，切片颜色介于金色和蓝色之间时表明厚度适中。铜网干燥后，使用镊子将铜网从loop上面拿下来，可以直接用于电镜检测。