国家蛋白质科学研究（上海）设施安装、调试、验收完成

5.3.1　核磁设备的安装方案及过程记录

核磁间的场地建筑、电源装置、气体供应以及管道、空压机房和空压机组、中央空调设备、空调室外机和超低温探头冷却系统室外机位置，均经检验，符合要求。场地建筑的防振、防电磁干扰情况符合工艺要求的标准。仪器生产销售方须在仪器安装之前，检查场地建设和辅助配套设施，以确保场地建筑及配套符合安装要求。初安装时所用的液氦、液氮由销售方提供（合同约定）。5台仪器之间须有一定间隔（5高斯磁场线以外），具体位置由仪器生产销售方根据要求来确定。先确定磁体的具体位置，在生产销售方的指导下进行地面的减振处理。基建完工交付使用的核磁大厅如图5-11所示。这是一个长20 m、宽20 m、高6.5 m的独立空间。为了采光和洁净的要求，特别设计了室内开窗和顶棚着色的修改方案。

图5-11　基建完工交付使用的核磁仪器大厅（详见下载图5-11，下载网址见31页脚注）

核磁共振系统的5台仪器在大厅中的摆放平面示意图如图5-12，图中绿色方框为减振基础地基的范围，蓝色圆圈代表每个磁体的5高斯磁场范围，除放置5台现有高场核磁谱仪外，还预留了1／4的面积，已经做好减振基础，为将来新的核磁设备安装，做好了地基和减振的基础准备。

图5-12　5台核磁谱仪在大厅中的摆放平面示意图及减振基础位置示意图（彩图见图版第17页）

图5-12中的场地，为单间正方形平房建筑。中间为通道，便于人员和物体通行。核磁间建筑满足要求：净高6.5 m，地基夯实，能够承重，能够防振。磁体安装完成后，再建造和安装物料进出口大门。物料进出口大门要求：共4扇门，宽2×1.5 m；高2.2 m+1.2 m。为加液氦或者大型物体进出开4扇门，每扇3.0 m×3.4 m；为平时加液氮开一扇小门，1.5 m×2.2 m。场地的通道要求无障碍，供安装时大型磁体通行，以及平常运行时液氮、液氦罐通行。

900 MHz和800 MHz仪器需要建造不锈钢质阶梯，供加样和实验操作之用，如图5-13所示，包括侧面图和俯视图。

按照节约场地空间和使用方便的原则，把配有超低温探头的3台谱仪置于面积较大的一边（东边），制冷系统室的外机正好位于墙外，使得所用管道较短。将最高场谱仪（900 MHz）安排在边上，靠近主楼一侧，远离道路，其他谱仪依次排列。固液混用700 MHz谱仪由于需要经常的气体供应，置于靠近气体房的一侧。常规600 MHz谱仪由于经常用于滴定实验和预实验，置于靠近样品准备室的一侧。

图5-13　与900 MHz和800 MHz谱仪配套的无磁性不锈钢阶梯设计图

所有5台核磁仪器作为一个整体，统一合同订货。一般中、低磁场仪器6个月内到货，高磁场仪器9～12个月到货，因此系统的核磁仪器安装，可分为2批进行。

图5-14是Bruker 600 MHz谱仪相关货物从海关到安装场地的运输过程记录。

900 MHz谱仪的货物和安装工具比较多也比较复杂，因此德国Bruker厂家的工程师全程从海关陪同，运输到卸货平台，再用吊车把谱仪取出，最后用气垫平稳地把磁体移动到安装位置，如图5-15所示。

Agilent 800 MHz则用龙门吊进行安装，需多人协调配合。安装过程中，既要保证当前安装磁体的位置准确无误，也要保证已安装好的其他磁体不受影响，如图5-16所示。

磁体安装完成后，对核磁仪器间的建筑物进行2次装修和场地清洁工作。5台磁体各自的整体安装过程，从2013年5月开始，到2013年9月结束，如图5-17的记录所示。

图5-14　Bruker 600 MHz谱仪从海关到安装场地的运输过程

图5-15　900 MHz谱仪到货现场

图5-16　800 MHz谱仪的安装现场

图5-17　核磁谱仪到货、安装和调试的时间过程

安装完成后，开始磁体的抽真空、灌液氦与液氮、升场和调试等过程。

5.3.2　核磁设备的调试方案及过程记录

按照从设备到模块再到系统逐渐升级调试的原则，首先调试仪器设备，主要由仪器生产销售商完成；然后调试各模块的协调能力，由系统技术人员进行，主要考察模块内仪器设备的组合与链接、各仪器使用时间的均衡性和协调性。最后调试系统的模块集成效率和系统之间的协调（如跟规模化蛋白质制备系统和数据库与计算分析系统之间的关系）。

5.3.2.1　仪器设备的调试

根据合同所规定的技术指标，逐一进行调试，使每台仪器及辅助设备均达到出厂要求的主要技术指标（见图5-18）。

图5-18　核磁设备技术指标测试验收情况

Cryo-Probe：低温探头。RT-Probe：室温探头。EB、ETB：己苯（ethylbenzene）。

主要调试内容如下。

①磁体调试：要求磁场漂移在一定范围以内，液氮、液氦的日消耗量符合要求。

②通道调试：要求每台仪器的脉冲发射通道和信号接收正常。

③超低温探头调试：要求满足厂商提供的技术要求，制冷系统和探头的灵敏度达到技术要求。用低浓度或含高盐样品调试低温探头的灵敏度。

④中央空调和空压机装置调试：须符合要求，正常运转。

⑤核磁图谱分析测试：利用厂家提供的标准样品，对每台仪器进行图谱采集和调试。该项由系统技术人员和生产厂家协作完成。

5.3.2.2　模块的调试

①样品准备：主要备齐一些基本的小型仪器、实验用品、材料和试剂，调试各种样品（如固体、液体）的配制与准备。

②核磁数据分析和结构计算模块：主要是软件的安装和测试，与核磁仪器计算机网络接通，使之可以进行数据传输。利用新采集的核磁数据，调试软件的运行和图谱解析的状况。调试结构计算软件和蛋白质结构解析的运算速度。

③模块间链接调试：保证网线连通，数据传输正常，并且样品准备、数据采集和数据处理三者的联系渠道畅通。

5.3.2.3　系统运能的调试方案

选取几个不同分子量大小和溶解度的蛋白质，分别进行样品配置、核磁共振数据采集、图谱分析处理、结构计算和动力学分析。所有设备的安装调试和测试，主要在周界文的带领下，由技术主管刘志军和工程师薛红娟组织Bruker和Agilent核磁工厂的工程师完成。主要的调试内容有以下这些。

（1）调试各种脉冲实验：同核和异核、多维图谱、TROSY和NOESY谱、RDC实验、核磁滴定、动力学分析等。

（2）调试各种分子量的蛋白质：试验多肽（＜5 kDa）、小蛋白质（5～20 kDa）、中等蛋白质（20～30 kDa）和较大蛋白质（＞40 kDa）的结构测定和动力学分析操作。选取固体蛋白质和膜蛋白进行结构测试和动力学分析。与国内实验室建立联系，测试国内实验室所提供的多种液体和固体的蛋白质样品。

（3）调试低浓度的蛋白质：用溶解度较低的蛋白质样品（如0.1 mmol／L）进行结构测试和动力学分析。

（4）调试高盐蛋白质样品：主要调试低温探头的工作状态及灵敏度。

（5）调试分析计算能力：利用不同的二维、三维或四维图谱，调试分析计算软件和系统之间的协调能力。选择已知结构的蛋白质的核磁共振数据，进行图谱分析和结构计算的调试。

（6）培训技术人员：由仪器商进行，主要目的是提高技术人员的整体操作和运行能力。

（7）进行规章制度建设：系统管理和规章制度建设，依据中科院条财局制定的《大科学装置管理办法》和上海设施相关的管理办法，结合核磁系统和设备的实际情况，制定高效合理的规章制度，具体内容如下。

①制定《NCPSS^[13]核磁实验用户课题申请表》，明确用户课题申请流程和管理办法。

②组织系统管理人员制定并学习《国家蛋白质科学中心（上海）核磁共振谱仪的使用管理办法（试行）》。从培训制度、仪器预约制度、仪器使用管理细则、违规惩罚规则等4个方面制定了详细的规章制度。

③制定针对公司用户、外部科研用户和内部用户的不同收费标准。特别制定针对公司用户的《核磁系统仪器使用管理规则（公司版）》。

④根据实际情况，制定《核磁谱仪上机日志与实验记录》《核磁设备维护管理流程》和《核磁设备紧急状态处理办法》等规章制度。

⑤在日常实验中积极解答并排解每个用户的各种问题，帮助用户分析处理核磁谱图。先后4次组织用户集中培训与上机实践。

在2013年11月，5台核磁谱仪全部安装调试完成后，因“发明了利用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法”而获得2002年诺贝尔化学奖的K.Wüthrich教授先后2次现场考察了中心的核磁共振分析系统。Wüthrich对Bruker和Agilent两家公司新核磁设备的性能，以及设备安装调试的场地保障情况，进行了详细的了解。他充分肯定了核磁系统的整体配置和900 MHz核磁谱仪对于膜蛋白科学研究的重要性，对核磁分析系统建设中所取得的进展表示赞许。

5.3.3　核磁设备的验收方案与指标

5.3.3.1　满足验收的工艺流程

核磁共振系统各模块的设备运行正常，系统中各模块相互之间连接贯通，基本满足正常科研和测试的需求。核磁系统3个模块之间的衔接关系和工艺流程与216页图5-1所示的基本相同，只是原来850 MHz液体、700 MHz液体和700 MHz固体三台谱仪换成900 MHz液体、800 MHz液体和700 MHz固体三台谱仪。

5.3.3.2　验收方案与指标

系统的仪器设备、模块安装和调试已经完成，经过一定时间的试运行后，先进行系统的自验收，然后进入系统的总体验收阶段。由上海设施邀请相应的专家，从设备、模块和系统各个层面进行验收。在设备层面，由于各设备具有相对独立性，必须达到或超过该设备的具体技术性能指标；在系统和模块层面，必须达到或超过该系统和模块的具体科学技术指标。

设施的各种设备、模块和系统调试后，通过自选和公开征求的方式选取一定数量蛋白质。试运行一段时间后，各项主要技术指标达到最初设计要求。具体技术状态指标详见216—219页5.2.1小节初步设计方案的目标和要求内容。

关于具体的验收方案，首先由系统根据前一阶段的试运行情况，向专家委员会提交相应的试运行报告。其次，由设施方、专家委员会或第三方提交具体试验样品，针对系统、模块和设备的各级技术指标进行验收试验，确保结果达到或者超过相应标准的要求。

5.3.4　核磁设备工艺验收的测试报告

5.3.4.1　概述

核磁系统的建设目的，是利用先进的核磁共振技术，测定蛋白质的溶液及固体三维结构和动力学，研究蛋白质的相互作用和蛋白质的生物功能，尤其是膜蛋白的结构与功能，以及基于蛋白质靶点的药物筛选和设计等。同时，系统负责人周界文和技术主管刘志军，也致力于核磁共振的新技术开发和新方法学研究，为用户提供生物大分子结构与功能的科学研究能力和技术支撑服务。

核磁系统共配备有5台核磁谱仪，包括高场核磁共振系统——液体的Bruker 900 MHz、Agilent 800 MHz，以及2台中场Bruker 600 MHz、Agilent 600 MHz谱仪（全部配备有超低温探头）和1台固液通用的Agilent 700 MHz谱仪（配备有固体Bio MAS探头和液体室温三共振探头），还有若干配套运行设备和计算机集群。所有设备的安装、调试、测试和技术验收工作如前所述，由本系统技术人员组织生产销售方的工程师来完成。

5.3.4.2　测试报告

进行验收实验测试和撰写工艺验收报告主要由技术主管刘志军、应用主管欧阳波和设施用户李华完成，薛红娟完成实验档案记录工作。工艺验收测试报告由系统负责人周界文主讲，上海设施组织专家组验收。

1.蛋白质结构数据图谱采集能力

验收指标：系统5台核磁谱仪每年能够测试4 800套（4 500+300）二维谱数据、700套（600+100）三维谱数据。

测试方法：5台核磁谱仪均能在1 h内采集二维的HSQC或TROSY图谱，能在2 d内采集HNCO或HNCA等三维图谱。通过不同样品、不同类型的二维和三维图谱采集，如HSQC、核磁滴定、异核相关、NOESY谱、动力学数据图谱等，完成各种类型图谱的数据采集量。

（1）测试设备：Agilent 600 MHz

测试方法：用13 C-15 N标记的膜蛋白M2，采集三维的HNCA、HNCOCA等图谱^[14]。

测试结果：2 d内采集到了三维的HNCA、HNCOCA图谱，具有很好的图谱采集能力，如图5-19所示。

（2）测试设备：Agilent 700 MHz

测试方法：用15 N标记的Se（硒）水溶性蛋白质采集TROSY图谱。

测试结果：1 h内采集到高分辨率的TROSY图谱，仪器已具有很好的图谱采集能力，如图5-20所示。

（3）测试设备：Agilent 800 MHz

测试方法：用15 N标记的Mg ATP转运蛋白采集TROSY图谱。

测试结果：1 h内采集到高分辨率的TROSY图谱，如图5-21所示。

（4）测试设备：Bruker 600 MHz

测试方法：用13 C-15 N标记的Mg ATP转运蛋白采集HNCO、HNCA等图谱。

测试结果：14 d内采集到全套主链归属的HNCO、HNCA等图谱，如图5-22所示。

图5-19　膜蛋白HNCA谱图

图下侧31N、32I、34G、34I、36L、37H、38F、39I、40A是对应谱图的氨基酸序列的编号和氨基酸名称代号。

图5-20　15 N标记的Se水溶性蛋白质的TROSY图谱(www.xing528.com)

图5-21　15 N标记的Mg ATP转运蛋白的TROSY图谱

（5）测试设备：Bruker 900 MHz

测试方法：用2 H-15 N标记的Mg ATP转运蛋白采集二维的TROSY等图谱。

测试结果：1 h内采集到高分辨率的TROSY图谱。与600 MHz相比，其分辨率有很大的提高，如图5-23所示。

2.蛋白质样品分析和结构解析能力

验收指标：每年能够进行20～30个蛋白质的动力学分析研究。

图5-22　用13 C-15 N双标记的Mg ATP转运蛋白采集的HNCA图谱

图5-23　用2 H-15 N标记的Mg ATP转运蛋白，采集二维的TROSY等图谱

（a）用600 MHz谱仪采集；（b）用900 MHz谱仪采集。

测试方法：能采集全套三维图谱，包括HNCO、HNCACO、HNCA、HNCOCA、HNCOCACB、HNCACB、NNOESY^[15]等，具备通过NMRPipe、XEASY、Ccp Nmr等软件，完成蛋白质主链归属的能力，以及使用PRE^[16]、RDC、NOE等技术，测定蛋白质空间结构信息的能力，能够通过XPLOR-NIH等软件，计算蛋白质的三维结构。

（1）测试设备：Agilent 600 MHz

测试方法：用13 C-15 N标记的Chimera-S31N M2蛋白，采集三维的HNCA、HNCOCA等图谱。

测试结果：利用HNCA、HNCOCA图谱，完成了100%Chimera-S31N M2蛋白的主链归属，如图5-24所示。

图5-24　用13 C-15 N双标记的Chimera-S31N M2蛋白采集的二维谱图

（2）测试设备：Bruker 600 MHz

测试方法：用13 C-15 N标记的Mg ATP转运蛋白，采集到全套三维HNCO、HNCACO、HNCA、HNCOCA、HNCOCACB、HNCACB、NNOESY等图谱，利用NMRPipe、XEASY、Ccp Nmr等软件完成蛋白质的主链归属。

测试结果：确定了80%以上的主链氨基酸残基的归属，如图525所示。

（3）测试设备：Bruker 900 MHz

测试方法：用2 H-15 N标记的Mg ATP转运蛋白，采集NOESY图谱。

测试结果：6 d内采集到高分辨率的NOESY图谱，可以观察到Mg ATP转运蛋白与底物的NOE值，如图5-26所示。

3.蛋白质及其复合物的动力学分析能力

验收指标：每年能够进行20～30个蛋白质的动力学分析研究。

测试方法：能够采集不同的动力学数据，包括测试T1／T2、水交换实验等技术，并对采集的数据进行分析，获得蛋白质的动态信息。

（1）测试设备：Agilent 600 MHz

图5-25　MgATP转运蛋白的序列与主链氨基酸残基归属的完成情况（彩图见图版第18页）

红：已完成指认；绿：不确定；黑：未指认；下划线：二级结构为螺旋区域；Helix：螺旋。

测试方法：用15 N标记的hltgβ7，采集一系列T2实验图谱。

测试结果：在不同的延迟时间下，蛋白质的不同氨基酸残基有不同的峰高，分析得到平均T2的时间为67.3 ms，如图5-27和图5-28所示。

（2）测试设备：Bruker 900 MHz

测试方法：用13 C-15 N标记的Mg ATP转运蛋白，采集HNCO-水交换实验图谱。

测试结果：4 d内采集到WEX-HNCO图谱，与溶剂有明显的交换，如图5-29所示。

4.蛋白质-配体相互作用的分析能力

验收指标：每年能够进行蛋白质-配体相互作用分析研究的样品达到300～400个。

测试方法：测试蛋白质与底物、抑制剂等化合物相互作用的核磁滴定。通过采集15 N-HSQC或15 N-TROSY谱，进行核磁滴定。根据信号的化学位移以及峰形变化，分析结合的部位和强弱。利用NOE和PRE等，实验测定结合的部位或强弱。

图5-26　用2 H-15 N标记的Mg ATP转运蛋白采集的NOESY谱图

（1）测试设备：Agilent 600 MHz

测试方法一：用15 N标记的CD3-mut蛋白，采集在不同Ca2+浓度下的TROSY图谱。

测试结果：蛋白质的化学位移随Ca2+浓度的变化而发生改变，如图5-30所示。

测试方法二：用13 C-15 N标记的Mg ATP转运蛋白，采集HNCO图谱，测定PRE的数据。

图5-27　用15 N标记的hltgβ7，采集一系列T2弛豫实验图谱

横坐标是1 H化学位移，纵坐标是15 N化学位移，单位都是ppm。

图5-28　用15 N标记的hltgβ7，采集一系列T 2弛豫数据分析

图5-29　用13 C-15 N标记的Mg ATP转运蛋白，采集顺磁弛豫实验图谱

图5-30　用15 N标记的CD3蛋白，采集在不同Ca2+浓度下的TROSY图谱（彩图见图版第18页）

图5-31　用13 C-15 N标记的Mg ATP转运蛋白，测定顺磁弛豫增强（PRE）实验数据（彩图见图版第18页）

（3）测试设备：Agilent 800 MHz

测试方法：用15 N标记的FAT蛋白，采集TROSY图谱。加入不同的多肽CD4、CD8，检测其结合与作用情况。

测试结果：采集到的TROSY图谱表明，CD8、CD4的加入，引起了FAT蛋白个别峰的位移，说明FAT蛋白的结构没有发生大的变化，只有个别氨基酸受到影响。如图5-33所示。

（4）测试设备：Bruker 600 MHz

测试方法：用13 C-15 N标记的p7离子通道膜蛋白，采集TROSY相互作用图谱。

测试结果：一系列采集到的TROSY图谱显示了HMA分子与p7的结合，其结合位

测试结果：每16 h内采集到1个高分辨率的HNCO图谱。通过一系列不同浓度的Mn ATP和Mg ATP滴定，获得不同氨基酸残基的PRE数值，如图5-31所示。

（2）测试设备：Agilent 700 MHz

测试方法：用15 N标记的Se-2水溶性蛋白质，采集TROSY图谱，加入不同浓度的小分子化合物9301。

测试结果：Se-2蛋白的化学位移，随着小分子化合物的加入而发生明显改变，如图5-32所示。点与金刚烷胺类似，如图5-34所示。

图5-32　用15 N标记的Se-2水溶性蛋白质，采集TROSY图谱，加入不同浓度小分子化合物9301（彩图见图版第19页）

图5-33　用15 N标记的FAT蛋白，采集TROSY图谱（详见下载图5-33，下载网址见31页脚注）

5.固体蛋白质的核磁共振分析能力

验收指标：每年能够进行8～10个固体蛋白质样品的分析研究，获得2～3个蛋白质或多肽的固体结构，并进行动力学分析。

图5-34　用13 C-15 N标记的p7离子通道膜蛋白，采集TROSY相互作用图谱（彩图见图版第19页）

测试方法：固体探头安装调试完毕，可达到实验要求。

◎测试设备：Agilent 700 MHz

测试方法：用金刚烷胺的样品进行测试。

测试结果：具备应用固体核磁共振技术的能力。

5.3.4.3　测试结论

测试专家意见

对上海设施的蛋白质核磁分析系统，进行各项指标的测试，结果表明，目前核磁系统的5台核磁仪器包括Bruker 900 MHz、Bruker 600 MHz、Agilent 800 MHz、Agilent 700 MHz、Agilent 600 MHz已全部到位，顺利完成安装与调试，并达到如下5项验收指标和能力。

①系统5台核磁谱仪每年能够测试4 800套（4 500+300）二维谱数据、700套（600+100）三维谱数据。

②每年能够分析的样品量，大于100个蛋白质及复合物。解析20～30个蛋白质的溶液三维结构，其中蛋白质复合物、膜蛋白或分子量大于30 kDa的蛋白质10个。

③每年能够进行20～30个蛋白质的动力学分析研究。

④每年能够进行蛋白质-配体相互作用分析研究的样品，达到300～400个。

⑤每年能够进行8～10个固体蛋白质样品的分析研究，获得2～3个蛋白质或多肽的固体结构，并进行动力学分析。

通过支持多个课题组完成不同的实验，满足其对核磁实验的不同要求，证明核磁系统已具备设计指标中的各种能力，达到一定规模的蛋白质样品分析和结构解析能力，具备了多种时间尺度内蛋白质及其复合物动力学的分析能力，以及应用多种手段测定蛋白质与配体相互作用的能力。

工艺验收专家：施蕴渝、金长文、王俊峰

工艺验收时间：2014年2月20日