小角X射线散射(small-angle X-ray scattering,SAXS)技术,是分析溶液状态生物大分子结构及其变化的强有力工具。自20世纪30年代开始,在物理科学、材料科学及生命科学领域内,以非晶体状态样本为研究对象,从样本小角散射图样中获取结构信息的方法学取得了长足进步[1]。从20世纪70年代开始,先进X射线光源、中子源以及小角散射实验室光源等科学仪器的开发与基于散射数据的计算方法学,都取得了重大发展[2],这也直接拓展了小角散射技术在结构生物学领域的应用范围。一方面,这些应用开始初现成果,另一方面,来自许多不同领域的学者又迫切需要有一种能表征他们研究体系结构参数的方法[3]。于是,生物化学领域内对小角散射方法学及其生物应用研究的兴趣也被重新点燃[4,5]。文献搜索数据库Pub Med(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)的数据统计资料显示,若采用“SAXS”作为关键搜索词,文章标题或者摘要中相关的生物学研究文献,从2000年的63条迅速增长到2017年的12 000条。在这样的时代背景下,依托上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,建成了我国首条适用于生物溶液样品小角X射线散射研究的专用线站——BL19U2生物小角X射线散射线站(biological small-angle X-ray scattering,BioSAXS)。该线站是上海设施蛋白质动态研究系统的一个重要组成部分。作为国内首条专门用于生物样本SAXS研究的技术平台,BL19U2线站的建成,在我国结构生物学研究领域具有相当重要的实际意义。
4.1.1 X射线小角散射基本原理
4.1.1.1 X射线散射
X射线散射的发生,是由于X射线与待测样品中的电子发生相互作用。在散射实验中,光源点与样品的距离以及样品与探测器的距离(L 2),都是宏观量(计量单位为“米”量级)。样品中结构不均匀性的特征尺度(d,100~103 nm),要远小于这些距离;而入射粒子的波长λ则更小(亚纳米量级)。在这种情况下,有所谓的菲涅耳数(d 2/λL 2>>1)。这意味着,可以将入射波和任意方向上的散射波,视作平面波来处理(图4-1)[6]。
图4-1 小角X射线散射的基本原理(彩图见图版第9页)
下角标i和s,i:入射光(incident);s:散射光(scattered)。(图片改自[1][1])
当某一物体被波矢为k=|k|=2π/λ的单色平面波辐照时,该物体内的原子会与入射平面波相互作用,而发射球面波。本章将只讨论与结构研究相关度最高的弹性散射。在这种情况下,散射仅依赖于散射矢量q=k′-k。X射线的弹性散射过程,可以使用量子力学中的一阶波恩(Born)近似来描述[7],即每一个散射源只与入射场相互作用,而不是与整体场。在散射场远小于入射场的情况下,这种动力学近似是足够精确的,因此可以忽略多级散射,而波恩近似仍然成立。
弹性散射归因于相干散射体积内的每一个散射源所产生的散射波之间的干涉。这里的相干散射体积,是指散射源在空间上的位置有相干性(如溶液中的单个蛋白质分子,见图4-2)。散射过程涉及散射物质分布的“真实”实验室空间坐标r,与测量散射强度倒易空间中的散射矢量q之间的转换。在波恩近似下,这种转换满足傅里叶变换。值得强调的是,傅里叶变换满足真实空间与倒易空间之间的倒易性,即在真实空间中“尺寸”越小,在倒易空间中“尺寸”越大(图4-3)。对于溶液来说,散射是各向同性的,散射强度只依赖于散射矢量的模|q|=q=(4πsinθ)/λ。
入射波与样品之间的相互作用强度,用图4-4所示的微分散射截面描述。微分散射截面是指,单位立体角、单位时间内的散射能量与单位面积内的入射波能量(即入射能量I 0)之比。很明显,该比值有面积的量纲。
N个散射源在各自的位置r i产生散射波,总的散射振幅是各个散射波的叠加。单个散射波的振幅用因子b i表示,即散射长度,具有长度单位厘米。物体的总散射振幅A(q)依赖于单个散射源的性质(即散射长度)和相位因子exp(i q·r i),表示为:
图4-2 弹性散射示意图
两条入射光束被相距为r的两个散射中心散射,散射角为2θ。不同位置处的原子发出的散射波会相互干涉,因为它们之间的相位不同。注意|q|=q=2·(2π/λ)sinθ=(4πsinθ)/λ。(图片改自[2])
图4-3 小角散射实验和真实空间与倒易空间之间的傅里叶变换(图片改自[2])[被授权于Svergun and Koch(2003)©IOP Publishing Ltd,2003]
因此,散射振幅是散射源分布的傅里叶变换。
如果包含N个散射源的图像,可以有任意的取向(如气体中或溶液中的分子),则相位因子可用如下的公式表示,其中尖括号表示球谐平均[2]:
图4-4 散射截面的定义
I e(q)表示在2θ方向上散射能量/(单位立体角×s);I 0表示入射能量/(单位面积×s)。两者之间的比值得到散射截面的面积量纲。L 2是样品到探测器的距离。与立体角dΩ相关的面积是dΩ,被探测器接收的能量是其中I e为电子的散射强度;s为散射矢量;I meas表示探测器收集到的测量散射强度。(图片改自[2])
尽管一个物体可能由一些离散的散射源所组成,但是使用连续的散射长度密度ρ(r)去描述该物体,往往更为方便。这里ρ(r)的意义是单位体积内原子的散射长度。对于硬X射线来说,可以只考虑X射线与电子的相互作用,因为电子的质量远小于质子。对于单个电子,其Thomson半径或经典半径为b=r 0=2.82×10-13 cm。因此,对于一个置于原点,且径向电子密度分布为ρ(r)的原子有:
由于原子的向前(q=0)散射长度为b x(0)=Zr 0,其中Z是原子序数。
4.1.1.2 生物大分子散射
原子聚集体的散射强度,可以方便地用散射长度密度分布ρ(r)表示。大分子溶液散射实验,需要独立收集溶液和溶剂的散射数据(图4-4)。溶液的散射强度扣除溶剂的散射强度,即为样品粒子的净散射强度。假设溶剂是一个具有恒定散射密度ρs的常规矩阵,则单个粒子的散射长度与相同体积溶剂的散射长度之差,被定义为散射长度密度差。用公式表示为△ρ(r)=ρ(r)-ρs。散射长度密度分布和散射振幅通过傅里叶变换相联系:
其中积分区域为粒子体积(V)。通常来说,散射振幅A(q)是一个复数。实验可以直接测量的是散射强度而不是散射振幅,散射强度是散射振幅的平方,I(q)=A(q)A★(q),即相应于散射能量。对于单色波来说,散射强度即为在给定方向2θ上单位时间、单位面积内被散射的光子或中子数。从图4-4定义的散射截面可知,探测器测得的散射强度为:
对于单色波,在时间间隔△t内,探测器单像素点面积A内的光子或中子计数N meas(q)为:
由于散射强度与散射截面存在正比例关系,因此接下来将散射截面也称为散射强度,尽管这样不完全精确。
现在考虑一个由相同粒子组成的聚集体,它的总散射强度依赖于粒子在样品中的分布。物体(被辐照的总体积)的总散射密度是粒子密度分布函数△ρ(r)与一个描述粒子在辐照体积内位置和方向的函数d(r)的卷积[3]:△ρ总(r)=△ρ(r)*d(r)。
根据傅里叶变换的性质,聚集体的散射振幅是两项分别做傅里叶变换之后的乘积A总(q)=F[△ρ(r)]×F[d(r)]=A(q)F(q)。在一定的条件下,测得的散射强度也是两项的乘积:I总(q)=I(q)S(q),其中第一项依赖于粒子的结构,而第二项依赖于它们的分布(见图4-5)。
图4-5 晶体的衍射(第1行)和溶液的散射(第2行)过程示意图
最右边为典型的探测器接收的图样(该图示例为X射线);上图为晶体衍射图样;下图为溶液散射图样(注意下图中的光束并不在中心)。(图片改自[2])
考虑两种极限情况。在一颗理想的晶体中,所有的粒子都有确定和相关的取向,并且在空间中具有规则的排列,因此须将所有单个粒子的散射振幅求和,以得到粒子间的干涉。被相干光照射的晶体,所产生的散射光也是相干的。最后的总散射强度,是由倒易晶格所决定的光在各个方向上的重新分布。测得的离散三维函数I(q hkl)相应于单个晶胞的散射密度分布[8]。这样产生的图像通常被称为衍射(而不是散射)图样(见图4-5第1行)。如果粒子是随机分布的,并且位置和取向没有相关性,则总散射强度并不是散射振幅之和。在这种情况下,相干体积是单个粒子的体积,不同粒子产生的散射光之间没有相干性。因此,整个聚集体的散射,是一个各向同性的连续函数。它正比于单个粒子散射强度在各个方向上的平均。单分散体系的生物大分子在特定溶剂条件下所形成的稀溶液,满足上述第二种极限情况。如果溶液中的粒子是随机取向的,且同时存在相互作用(非理想的半稀释溶液),则相邻粒子之间就存在相关性,这种相关性必须被考虑。这种聚集体的散射强度仍然是各向同性的,因为粒子的取向是随机的。对于球状粒子,其散射强度可以写成两项的乘积:I总(q)=I(q)×S(q)。在文献中,粒子散射强度I(q)和干涉项S(q)分别称为“形状因子”和“结构因子”。在生命科学中,小角散射被用于分析溶液中大分子的结构(基于粒子散射)和分子间的相互作用(基于干涉项)。半稀释溶液中分离的两项,可以通过在不同的浓度和溶剂条件(pH、离子浓度等)下进行测试而得到。对于由多种尺寸和形状各异的粒子组成的体系,其总强度是各种粒子散射强度的加权平均。上述情况适用于有限相干的X射线源。对于高度相干的射线源,如一些同步辐射源,即使对于各向同性的样品,也有可能观测到各向异性的散射(表现为探测器图样上的斑点)[9]。
式4-4中关于框函数的傅里叶变换表明,一个尺度为d的物体所产生的散射强度,主要集中于q=2π/d的范围内。因此,如果散射强度在倒易空间中处于q max的范围内,则可以得到其在空间中的分辨率△=2π/q。对于单晶来说,由于衍射强度重新分布,因此数据可以得到很高的分辨率(d≈λ)。对于从溶液样本得到的球谐函数的平均散射图样,I(q)通常随着散射矢量而迅速衰减,只能得到低分辨率的结果(d>>λ),因此溶液散射不能获得原子的位置信息,只能得到分子的低分辨模型。因为溶液中粒子的位置取向是随机的,小角散射数据只包含非常有限的结构信息。估计值2π/q只表示理论上能够收集到的结构分辨率,并非基于散射数据计算得到的分子模型实际分辨率。尽管在原则上,大分子溶液散射可得到很高的分辨率(甚至达0.2 nm,即所谓的广角散射——wideangle X-ray scattering,WAXS),然而在实际的数据分析过程中,即使获得了高质量的广角散射数据,也不可能构建一个如此高分辨率的唯一模型。
图4-6 小角散射的密度对比度示意图
图片改自[2]。
如前所述,小角散射产生于溶液中由X射线引起的电子密度浮动。溶液中生物大分子的平均分子电子密度与溶剂密度的差为△ρ=<△ρ(r)>=<△ρ>-ρs,被称作对比度。这是样本的另一重要特征。图4-6为对比度概念的示意图。
粒子的散射密度可以表示为ρ(r)=△ρ*ρC(r)+ρF(r)。其中ρC(r)是形状函数,其在粒子内部为1,在粒子外部为0,故ρF(r)=ρ(r)-<ρ(r)>表示散射密度相对于其平均值的波动[10]。将此表达式代入方程4-1,散射振幅包括2部分A(q)=△ρ×A C(q)+A F(q),则平均散射强度可以写成3项基本散射函数之和:
其中,I C(q)、I F(q)和I CF(q)分别是由粒子的形状、密度浮动、横截项而产生的散射[10]。这个方程具有普遍的意义。通过使用不同密度的溶剂(不同的△ρ),可以独立地得到粒子整体外形的散射和粒子内部结构的散射。这种技术称为“对比调整”。
图4-7 X射线电子密度散射对比度变化的可能性
灰色区域显示了溶剂密度变化可达到的范围。X射线密度的变化可以通过添加小分子来实现。(图片改自[2])
小角散射实验的环境通常是水或水性溶液,其中可能包含一些盐或小分子。在X射线散射的情况下,水性溶液的电子密度在很大程度上依赖于这些盐或小分子。例如,纯水的电子密度是3.34×102 e·nm-3,[4]而1 mol NaCl溶液的电子密度是3.5×102 e·nm-3。蛋白质的平均电子密度通常在4.2×102 e·nm-3左右,比纯水高出0.854×102 e·nm-3,比1 mol的NaCl溶液仅高出0.701×102 e·nm-3。一个更突出的例子是蔗糖。质量浓度为500 g/L的蔗糖溶液,电子密度为4.00×102 e·nm-3,蛋白质溶液仅比其高出0.2×102 e·nm-3。在X射线散射中,生物大分子溶液的对比度可通过改变样品环境的电子密度来控制(见图4-7)。事实上,这个性质在蛋白质晶体学的早期被用来确定血红蛋白的分子包膜[11],后来又被成功用于小角散射,以确定番茄丛矮病特异性病毒的分子包膜[12]。原则上,X射线散射的对比度可通过对生物大分子标记重原子而得到提高,但是这种实验非常难做,罕有成功的例子。
4.1.2 生物X射线小角散射线站的科学目标与建设目标
基于上海同步辐射装置的生物X射线小角散射(biological small-angle X ray scattering,BioSAXS)光束线站BL19U2,主要面向生命科学、化学、材料学等领域,以生物大分子在自然状态下的结构、动态变化,以及生物大分子之间的相互作用为主要研究方向。该线站还同时兼顾聚合物、纳米材料以及液晶等研究对象的小角散射实验需求。BL19U2光束线重点开展液态样品的X射线小角散射工作,还有以时间分辨为主的动态过程研究工作。
通过测量X射线弹性散射在小角度范围内的强度分布,BioSAXS线站可以获得物质内部较大尺度(约450 nm)的结构信息。当前,BL19U2的研究内容主要集中在下面3个重要方向上:①单分散体系,即样品分子单一的溶液体系;②多分散体系,这种情况下样品有相同的化学组成,但是形状和尺寸不同;③混合体系,这种体系下样品分子的形状、尺寸和化学组成都不同。对于单分散溶液,净散射强度与单个粒子在各个方向的散射平均值成正比。这个平均过程使得小角散射无法像晶体学一样得到三维的散射密度。因此,小角散射只能得到粒子内部距离分布函数P(r)在各个方向的平均。很明显,它是个一维函数。
小角散射可以确定样品的摩尔质量(molecular weight,MW)以及整体几何参数,例如表示延展度的回转半径(radius gyration,R g)、分子外部的最大外径(maximum diameter,D max)、样品的水合体积(porod volume,V p)。另外,算法的不断开发升级,使用户不仅可以得到样品简单的一维结构参数,还可以进一步从散射数据,计算得到可信的三维结构。这些算法的可靠性,已在很多应用中被证实。从SAXS数据推导出的三维结构,被用来和样品已解析的晶体结构作比较,两者的一致性非常高。依据实验收集到的SAXS数据,还可以通过从头计算(ab initio)进一步优化高分辨的分子结构以及同源结构,得到基于散射数据的较低分辨三维模型(1~2 nm)。由上述第一种情况可以得到样品分子的外形轮廓,帮助用户对分子有一个直观的认识。第二种情况是小角散射与其他互补方法的结合使用,是生物大分子复合物建模的强有力工具。尤其当研究体系的空间结构变化与缓冲液pH变化或者与辅助因子/离子的结合相关时,SAXS是非常有效的结构生物学研究技术。除了建模之外,小角散射也常用于验证由其他结构学方法计算得到空间模型的准确性,定量分析低聚物的状态,以及估计混合物或多分散体系中不同组分的体积分数。
对于由K种不同散射长度密度(scattering length density)粒子组成的多分散体系或者混合物体系来说,其总散射强度可表示为K种组分的散射强度i k(q)的线性组合,其中V k>0(V k表示溶质体积分数):
在这种情况下,总体参数反映的是各种组分总体参数的平均值。当然,单从混合体系的散射数据,是无法得到每一种组分的结构模型的。如果已知单独每一种组分的散射强度,那么从方程4-7可以得到混合体系中每一种组分的体积分数。小角散射技术在多分散体系中典型的应用是标定多种寡聚物混合溶液的平衡状态,该技术也适用于分析更复杂的体系,比如柔性体系以及含有柔性链的多结构域蛋白质和无序蛋白质(intrinsically disordered protein,IDP)。
根据上述要求,本光束线站的光子通量(也称光通量)必须达到5×1011 phs/s以上,能量分辨率达到10-4数量级,能量范围为7~12 keV(该范围覆盖常用元素Cu-Mo的K吸收边[5]),光斑尺寸应不大于0.5 mm×0.2 mm(H×V)。
光束线采用波荡器(undulator)光源。光束线的设计目标如表4-1。
表4-1 光束线的设计目标
上述指标是根据理想状况估算出来的。考虑到实际建设中难以预测的因素,线站的设计指标如表4-2。
表4-2 线站的设计指标
X射线小角散射技术有广泛的应用。作为国内首条溶液样品小角散射的专用线站,BL19U2与国际同类线站的性能指标相比,已经处于国际领先水平。表4-3为位于上海同步辐射装置的BioSAXS线站与位于德国汉堡Petra III同步辐射装置的国际一流BioSAXS线站的性能指标对比。
表4-3 BL19U2与国际上第三代光源中的一流小角散射光束线站的性能指标对比
4.1.3 生物X射线小角散射线站的设计——光源点与前端区
BioSAXS的关键是获得高质量的入射X光。高亮度是减小样品用量和进行时间分辨测量的保证,低散射角的指标则要求入射光有良好的平行度,因此需要利用波荡器产生低发散度(发散角)的X光。直线节[6]的光源参数见61页表3-2。作为上海光源首条共用一个直线节引出2条canted光束线的线站,生物X射线小角散射光束线BL19U2与生物大分子复合物结构光束线BL19U1共用一个直线节,并采用同一块偏转镜进一步分离前端区引出的2束光路。因此,BL19U2部分光学元件的参数可参考83—93页“3.4 蛋白质复合物晶体结构线站(BL19U1)”对应的描述。整体而言,BL19U2是从储存环直线节引出的波荡器光源,具有高通量、低发散度和一定的相干性。对于上海光源3.5 Ge V的电子能量,要在7~15 keV能区获得高亮度的同步光,就需要用短周期波荡器,并利用波荡器产生的高次谐波来覆盖所需的能量范围。
上海同步辐射装置储存环电子轨道设计所允许的最小间隙为6 mm,若要得到连续的光子能量(波长)覆盖7~15 keV能级,则要求波荡器周期长度不小于2.4 cm。3种不同周期长度波荡器(U25、U22、U20)的亮度与通量曲线如84页图3-28、85页图3-29所示。平衡了波荡器长度、能区亮度、调谐能力等各方面的综合因素,BL19U2光束线选取了U20波荡器作为束线光源。该波荡器在常用的能量段12 keV附近具有较高的通量和亮度,同时可以覆盖7 keV的低能区,完全可以满足BL19U2光束线的设计指标。
从波荡器发出的同步辐射光经过前端区后进入光束线。关于BL19U2光束线前端区内级联插入件、固定光阑1、活动光子挡光器2各部件的功能与作用,请参考第3章有关复合物线站的描述(见64—65页“3.3.2.2 工作模式”)。前端区的安全、可靠、稳定运行,是整条光束线能够平稳运行的基础与保障。BL19U2的前端区总体布局如63页图3-4所示,布局图中各部件的相关描述请参考第3章有关前端区的内容(62—65页“3.3.2 前端区”)。与BL19U1光束线一样,BL19U2前端区的工作模式分为运行状态、待机状态、停机状态3种模式,相关图示参见64页图3-5。3种工作模式的具体内容以及切换方式请参考第3章相应内容(64—65页)。根据光束在各个位置束斑大小的同步光追迹模拟结果(参见65页图3-6),确定了各主要受光元件的位置、孔径、长度等信息(参见66页图3-7)。除同步光追迹外,BL19U2生物小角X射线散射光束线,还针对辐射屏蔽保护设计,开展轫致辐射的计算、追迹(参见66页图3-8、67页图3-9)。有关前端区真空的分布与相应设计指标的描述,请参考103页图3-60以及第3章关于真空部分的相应内容(102—103页“3.6.2 真空系统”)。
4.1.4 生物X射线小角散射线站的设计——光束线
4.1.4.1 光束线的物理设计
同步辐射光经由前端区进入光束线。光束线根据实验需求,对同步辐射光进行单色化、聚焦以及真空隔离等必要的处理,将满足要求的同步辐射光输送到实验站,用于用户实验。整体光束线主要由垂直聚焦镜、水平聚焦镜、狭缝、位置探测器、真空系统、真空支架、阻挡器、光闸、光学棚屋、光束线公用设施设备以及人身与设备保护系统、辐射防护系统等组成。
简单而言,BL19U2光束线在束线前端区出口处安装了辐射吸收器,阻挡前端区的轫致辐射。后面通过调节水冷四刀口狭缝,将光束接收角范围限制在水平0.1 mrad和垂直0.05 mrad。水冷狭缝后安装了单色器,是光束线的关键光学部件之一。单色器的真空性能较差,可采用真空差分系统或者铍窗,来保证束线上下游的真空性能满足束线运行的要求。
单色器采用固定出口的双平晶单色器,单色器晶体为Si(111)晶体。其主要物理参数及性能指标见表4-4。
表4-4 BL19U2双平晶单色器的主要物理参数及性能指标
单色器第一晶体承受高热负载,当白光狭缝限制的光束接收角为0.1 mrad×0.05 mrad时,晶体吸收的最大热负载功率为160 W(波荡器K值=2.0),晶体表面的最大热负载功率密度为25 W/mm2。因此,单色器的第一晶体采用液氮冷却。在大多数实验条件下,单色器第一晶体承受的热负载总功率小于110 W,功率密度小于15 W/mm2。为使第二晶体的晶面间距与第一晶体的相匹配,第二晶体也用液氮冷却。从热稳定性的要求考虑,第二晶体采用独立于第一晶体的液氮回路。2块晶体都采用间接冷却的方式。冷却所需的液氮由液氮循环系统供给,不用制冷机,这就保证了单色器系统的稳定性。液氮冷却部件与其他部件热绝缘,可能受液氮冷却影响的部件和可能受散射光照影响的部件,均采用水冷循环,屏蔽Compton散射[7],以保护敏感部件。单色器第二晶体上设有微调机构,可调节2块晶体的平行度,以及单色器出射光束方向的变化。
单色器后面安装辐射吸收器,阻挡前面吸收器泄露的轫致辐射。位于单色器后面的聚焦镜对真空度有更高的要求,因此单色器和聚焦镜之间有高低真空隔离的问题。这里同样采用铍窗或真空差分来完成。由于这里是单色光,铍窗不需要冷却。
在单色器之后放置有水平聚焦镜,其表面为镀硅(Si)反射层。水平聚焦镜使通过单色器后的单色光,水平聚焦于焦点位置(探测器表面)。光束掠入射角为3.8 mrad,在7~15 keV能够起到有效抑制高次谐波的作用。聚焦比为1﹕0.87,水平聚焦镜为侧面放置的子午压弯镜。
水平聚焦镜的后面是垂直聚焦镜,其表面为镀铑(Rh)反射层。聚焦比为1﹕0.73,垂直聚焦镜为向下放置的子午压弯镜。
光束在垂直聚焦后进入小角相机系统,后者由2个狭缝组成。最后,通过铍窗将光束引到实验站。此处铍窗的作用主要是隔离真空和大气。光束线具体的光学元件设置如图4-8所示。
图4-8 BL19U2生物小角X射线散射线站的光学元件设置示意图
采用光线追迹程序SHADOW,能够较好地模拟实际的光传输过程,其计算结果可作为实际光学性能的参考。用SHADOW追迹程序对光源点及光线的性能进行了模拟,模拟计算中已包括图4-8所示的各个光学部件的影响与贡献,并已考虑了单色器热形变和聚焦镜面形误差的影响。
1.光源点的特性
根据SHADOW模拟得到的光源点,大小约为0.37 mm×0.023 mm,光源点中心光锥的发散角约为62μrad×20μrad(参见89页图3-34、90页图3-35)。
2.能量分辨率和光子通量
进一步采用SHADOW模拟计算了12 keV时的光谱分布曲线,以及不同能量处的能量分辨率(参见90页图3-36和图3-37)。可以看出,在整个工作能区,能量分辨率均高于2×10-4。
3.聚焦光斑尺寸
用SHADOW模拟得到能量为12 keV时的聚焦光斑大小,约为97μm×60μm(参见91页图3-39和图3-40)。
4.光束发散角
用SHADOW模拟得到能量为12 keV时的聚焦光束发散角,约为97μrad×66μrad(见图4-9)。光束发散角基本上不随能量而变化。
4.1.4.2 光束线主要光学部件的性能指标
光束线实现功能的主要部件是光学部件,主要包括分光元件和成像元件。在7~15 keV能区的范围内,BL19U2光束线选择了Si(111)晶体单色器;成像元件则使用2个由平面镜压弯的柱面镜,分别聚焦弧矢方向和子午方向的X射线。
1.单色器
BL19U2 BioSAXS线站采用的单色器,为英国Oxford-Danfysik所提供。单色器第一晶体表面和布拉格转轴在位置和角度上精确重合,同时加装了Z方向平动调节机构。转轴与晶体的表面距离小于50μm。第一晶体表面功率密度分布参见87页图333。对这样高的热功率密度,一般要用液氮冷却,才能保证晶体的热形变足够小,而不影响晶体的分辨率(resolution)。双晶单色器主要物理参数及性能指标参见表4-4。
图4-9 BL19U2生物小角X射线散射线站在能量为12 keV时的聚焦光斑发散角
图4-10 BL19U2生物小角X射线散射线站的双晶单色器坐标轴定义(a)及结构原理示意图(b)
双晶单色器机械结构采用凸轮机构,其结构原理如图4-10所示。布拉格转轴位于第二晶体表面中心。作布拉格角扫描时,第一晶体支架沿特别设计的凸轮(cam)表面运动,以保持入射光在第一晶体上的照射位置和出射光的位置不变。这样的结构具有高稳定性和重复性的特点。在固定光束出口的条件下,光束在第二晶体表面的位置坐标会改变。为简化运动机构,第二晶体选用长晶体,从而满足布拉格扫描时光束在晶体表面沿Y轴的运动。第二晶体的Z方向平动调节,用于固定光束出射高度,调整光束在垂直方向上的位置移动。BL19U2线站光束在垂直方向上的位置偏差小于10μm,调节步长分辨率为0.5μm。第二晶体投角调节用于补偿失谐所造成的光子通量减少和光斑在垂直位置上的移动,其微调的步长分辨率为0.05 arcsec。第二晶体滚角调节会对光斑位置以及光子通量产生影响,其微调的步长分辨率为0.5 arcsec。
双晶单色器运动机构的主要技术指标,参见表4-5。
表4-5 双晶单色器运动机构主要技术指标
2.聚焦镜
聚焦镜是光束线上的另一个关键部件。BL19U2生物小角X射线散射专用线站,采用类K-B镜的聚焦方案,分别在距离光源点31.2 m以及34 m的地方安装了水平聚焦以及垂直聚焦的2个柱面镜,在2个方向上对光束进行聚焦。聚焦镜的具体性能指标如下。
(1)水平聚焦镜
水平聚焦镜的作用为:在水平方向对光束进行聚焦,同时抑制高次谐波。水平聚焦镜和位于其后端的垂直聚焦镜为一对K-B镜。水平聚焦镜选用侧面子午方向压弯的柱面反射镜,按照侧面放置的方式摆放。表4-6是反射镜的主要参数。反射镜表面镀Rh膜,采用3.8 mrad的掠入射角,在7~15 keV之间起到抑制高次谐波的作用,反射率如图4-11所示。水平聚焦镜放置于距离光源点31.2 m处,水平聚焦镜的聚焦比为1﹕0.87。
表4-6 BL19U2光束线反射镜光学元件的主要参数
(2)垂直聚焦镜
垂直聚焦镜的作用是:在垂直方向上将光束聚焦于样品;抑制高次谐波;使光束向下倾斜出射。垂直聚焦镜与水平聚焦镜类似,但垂直聚焦镜为面向下放置的子午方向压弯的柱面反射镜。与水平聚焦镜相比,因放置姿态不同,其在压弯方面的考虑也有所不同。垂直聚焦镜放置于距离光源点34 m处,垂直聚焦比为1﹕0.73。反射镜参数和反射率分别见表4-6和图4-11。
为保证聚焦镜表面不受污染,防止污染物影响聚焦镜的反射率,聚焦镜镜箱内应保证超高真空状态,动态真空应保证好于1×10-9 Torr。前面提到关键光学元件——单色器,由于受到装置要在真空中运动的相关机构限制,它的动态真空应在10-6~10-7 Torr。光束线上的X射线在束线管道内传输,由于传输距离较长,为保证尽量少的残余气体吸收,束线管道内的真空度要有比较好的高真空(<1×10-7 Torr)。为达到真空要求,束线基本上分为3个真空段。第一真空段为前端区出口到单色器入口,该段为超高真空段;第二真空段为双晶单色器,为高真空段,在单色器前后都有铍窗加以真空保护,或使用真空差分抽气;第三真空段为水平聚焦镜到光束线的出口,这一部分管道较长,真空度分布也不均匀,要求2个镜箱均为超高真空。
图4-11 BL19U2生物小角X射线散射线站水平聚焦镜镀Rh膜表面的反射率
(3)水平偏转镜
由于BL19 U2生物小角X射线散射光束线与BL19 U1生物大分子晶体复合物光束线共用一个前端区,因此在光束线距离前端的光源点28.5 m的位置,安装了一块侧向放置的平面镜,在水平方向上将X射线偏转7.6 mrad,以增大BL19 U1与BL19 U2两条光束线之间的夹角。由于镜子不需要压弯,故运动机构的调节精度也没有聚焦镜的要求高。水平偏转镜的主要物理参数与性能指标要求列于70页表3-5。调节机构的技术指标要求列于71页表3-6。
4.1.5 生物X射线小角散射线站的设计——实验站
光学棚屋末端是实验站位置,是用户进行生物X射线小角散射实验的地方。SAXS技术是检测物质微观结构的一项重要技术突破。近年来,随着同步辐射光源的应用与发展和分子生物学研究的不断深入,以及针对生物样本散射信号数据分析算法的不断进步,通过SAXS图谱分析蛋白质等生物大分子结构的计算方法,不再局限于简单的一维结构参数量化,而是逐渐扩展到三维结构的数据模拟[13]。现在可以根据SAXS散射数据,采用从头算法(ab initio)来获得生物大分子的较高分辨率(约1 nm)的三维结构,因此使得SAXS检测技术成为其他微纳米级分辨率结构的生物学检测技术的有效补充[14]。随着越来越多的生命科学研究者开始意识到SAXS在蛋白质结构解析研究中所具有的重要性,该技术在生物学领域内的使用需求,也逐年呈几何级数增长[15,16]。为了更好地满足生物溶液用户对SAXS检测的需求,BL19U2 BioSAXS实验站内设立了快速数据采集的探测器,以及多元化的原位样品检测装置。同时在实验数据的收集和处理方面,也实现了高效的自动化过程。生物X射线小角散射实验站主要由样品装置、SAXS小角相机系统、探测器系统、电子控制系统和辅助系统组成,详情如下所述。实验站内主要设备的设计及布局参见图4-12。
图4-12 BL19U2生物小角X射线散射线站实验站的主要设备设计及布局图
4.1.5.1 Pilatus混合像素探测器系统
BL19U2生物小角X射线散射线站采用Pilatus 1M混合像素探测器。该探测器的设计是X射线探测领域的一次革命性成果,能够实现最好的数据质量。该探测器将单光子计数和混合像素这两项关键技术相结合,应用于同步辐射和常规实验室光源的各个领域。单光子计数技术能够消除所有探测器的噪声,并提供优质的实验数据。在采集数据时,能够有效地排除读出噪声和暗电流的干扰。由于排除了暗电流和读出噪声,Pilatus探测器更加适合溶液样品同步辐射线站BL19U2数据收集的使用。混合像素技术直接将X射线转换成电子信号,可以直接探测和获取数据。与其他探测器技术相比,混合像素技术能够获得更优的空间分辨率以及更高的探测效率(图4-13)。这些再加上读取时间短和连续采集的特点,Pilatus探测器可以高效地提供优质数据。
图4-13 Pilatus混合像素探测器固态传感器直接检测X射线光子的原理
图片改自Dectris公司的相关产品说明书。
混合像素探测器中,每个像素由感光像素和读出像素两部分组成。X射线光子由感光像素直接转换为电荷信号,读出像素对电荷信号进行处理和计数。混合像素的每个独立像素中的感光像素和读出像素,都有直接的电子学连接,可以防止信号的串扰和损失,并提高探测器的灵敏度以及数据读取速度。具体探测器收集到的散射样品信号图示,参见图4-14。
(www.xing528.com)
图4-14 Pilatus混合像素探测器小角散射信号输出图像
Pilatus 1M混合像素探测器的技术指标和规格参见表4-7。
表4-7 BL19U2光束线实验站Pilatus 1M探测器的技术规格
4.1.5.2 小角相机设计
BL19U2实验站小角相机的设计原则为:散射背景减少,窗口材料密封,对狭缝、快门和衰减器布局合理;管道调节方便,管道节数尽可能少,多采用快接口,设计拆装方式合理,以及容易更换真空小嘴。小角相机的设计原理示意图参见图4-15。
为减少杂散背景信号,一般在两狭缝之间插入另外一道狭缝。BL19U2实验站采用三狭缝小角相机系统。样品到探测器之间的距离最长为7 m,可以根据用户实验需要以0.5或者1 m的可调距离进行设置。根据计算,得出距光源点35 m处的光束限制狭缝开口大小为2.8 mm×1.75 mm(H×V),49 m处的去除杂散光狭缝(guard slit)开口大小为1.0 mm×0.7 mm(H×V)。狭缝的设计参数见表4-8。
图4-15 BL19U2生物小角X射线散射线站小角相机狭缝布局的原理示意图
表4-8 BL19U2光束线实验站狭缝技术参数
用于阻挡直通光束的挡光元件(beamstop)直径为3 mm,采用水平和垂直运动滑台以及支撑架来实现运动调节和支撑。整个挡光元件运动机构,安装在真空腔体中。调节范围为(±25 mm)×(±25 mm)(H×V),调节分辨率为2μm,定位精度为10μm(约10%探测器像素尺寸),保证挡光元件位置的准确调节,以及所测试q值的范围和准确度。小角相机的快门系统开口直径为10 mm,相应时间为20 ms。小角相机系统配套的衰减器开口直径为10 mm,衰减过程可分三级实现1×1012~5×1010 phs/s@12 keV的光强衰减目标。
4.1.5.3 隔振平台和真空管道
隔振平台用于放置小角相机真空管道,并具有一定的振动阻尼效果。真空管道用于传输散射光子,防止空气对散射信号的吸收衰减。实验站的真空管道配备了管道开口为Φ20 mm以及Φ10 mm的两种管径。真空管道的直径为Φ350 mm。大管道长度分为1、1.5和2 m,再加挡光元件部分。真空管道支架的调节范围是水平方向±75 mm,垂直方向±50 mm。采用直径为3 mm的挡光元件时,样品到探测器距离所对应的q值范围如表4-9所示。
表4-9 BL19U2实验站可测q值范围
*SD:sample-to-detector distance,表示样品到探测器的距离。
真空管道的窗口采用云母和Kapton膜密封。其中云母用于密封样品前后的真空窗口,厚度约为10μm。Kapton膜用于密封探测器前的大真空管道窗口,厚度约为250μm。小角相机的整体布局如156页图4-12所示。
4.1.5.4 多维运动平台
实验站的支撑平台高度为700 mm。平台上安装有滑轨,支撑管道的支架安装在滑轨上,方便根据测试样品的需求来改变真空管道的长度。管道支撑主要在靠近实验棚屋内墙的方向;支撑平台在靠近实验棚屋入口的方向,预留有一定的空间,以放置设备及进行样品操作。平台的基本结构如图4-16所示。
图4-16 BL19U2生物小角X射线散射线站实验站支撑平台的示意图
该平台有6个自由度,即沿x、y、z三个方向的平移,绕x、y、z三个轴的转动。平台线性运动精度好于10μm,转角精度为0.005°。
4.1.5.5 样品装置以及样品检测环境
BL19U2实验站提供多元化的样品检测环境,适用于不同性状样品的小角X射线检测需求。先将常用的样品装置以及样品检测环境罗列如下。
1.单一蛋白质溶液蠕动样品装置
该装置采用美国汉密尔顿(Hamilton)蠕动液体进样泵,实现溶液的取样和分配,并配合毛细管样品池,组成蠕动样品装置。样品池中整合的毛细管壁厚为10μm,根据样品性质的不同以及实验用X射线能量的不同,线站提供内径为1、1.5以及2 mm的毛细管,供用户选择。对于10μm壁厚的毛细管而言,散射强度按照10 000来计算,使散弹噪声在<10的范围内变化,毛细管的壁厚要在±1μm。该装置配有水浴循环低温系统,温度在4~80℃之间可控。样品的蠕动速度为10μl/s。蠕动样品装置的主要部件参见图4-17。
图4-17 BL19U2生物小角X射线散射线站实验站的溶液样品蠕动装置
2.真空自动溶液样品装置
根据SAXS实验的基本原理,液态反应体系的散射信号,包括溶质的散射信号和溶剂的散射信号,而最后真正用于实验数据分析与大分子结构拟合的信号,则完全来自液态反应体系中溶质的散射。因此对于液态反应体系而言,在具体的SAXS实验操作中需要针对液态样本的溶剂以及溶剂与溶质的混合体系,进行2次独立的SAXS测量,而最后两者散射信号强度的差值,才是数据分析与结构拟合的依据[1]。这个测量过程要求完全去除液态反应体系中溶质散射信号以及实验装置可能引入的背景杂散射信号。对于液态生物样本而言,样本的主要组成成分为C、H、O、N、P等元素。这些原子经X射线照射后,对于X射线的散射程度非常低,从而使得液态生物样本的SAXS散射信号与样本缓冲液的本底散射信号之间强度的差值非常小(通常仅有不到一个数量级的强度差值)[17]。为了保证实验收集到的散射信号的准确性,BL19U2生物X射线小角散射实验站通过自主研发,配备了真空自动溶液样品装置,参见图4-18。
真空自动溶液样品装置的样品室为石英毛细管。整个SAXS测量过程确保能够在同一个样品室内完成,极大程度地避免了样品室材质(如样品室厚度以及样品室材质对X射线吸收程度)的差异所引入的散射信号微小差异。考虑到生物样本的特殊性,该装置整合了发光二极管(light emitting diode,LED)灯管,可以进行光照对不同光敏蛋白样品活性的影响研究。该样品装置的真空度维持在101 kPa,样品室内的真空环境可以最大程度避免由于空气散射所引入的杂散射对实验结果的影响。同时,该真空样品室配备一套完善的自动样本装置,以保证在线站上实现任何以高通量筛选为前提的实验。采用该自动进样装置,可以同时实现12个1.5 ml Ep管、32个500μl PCR管以及2块96孔板的高通量SAXS筛选。
图4-18 BL19U2生物小角X射线散射线站真空自动溶液样品装置(彩图见图版第9页)
(a)真空溶液样品室;(b)自动上样机械手;(c)高通量自动进样机械手。
3.高效液相色谱与小角X射线散射技术联用(SEC-SAXS)的溶液样品装置
为保证待测样本的均一性,提高生物样本散射数据的质量,BL19U2生物小角X射线散射线站通过整合高效液相色谱层析柱技术,实现了复杂生物体系的在线分离纯化SAXS检测。该SEC-SAXS装置依托美国安捷伦(Agilent)公司生产的1200型高效液相色谱仪以及美国怀雅特(Wyatt)公司生产的Dawn HELEOSII十八角度激光光散射仪和DynaPro Nanostar动态光散射仪(DLS)装置。通过自主设计改造,将溶液样品经由Agilent高效液相色谱仪(HPLC)的单元泵(流速范围为0.001~10 ml/min)泵入SAXS检测样品室,通过高强度的X射线来记录连续流体溶液体系内生物大分子的散射强度,进而阐释反应体系的形貌特征。Agilent系统配备的紫外(ultraviolet,UV)检测器,可以实时监控样品的分离纯化情况。Wyatt系统的十八角度激光光散射仪,可以同步实时提供高精度的样品粒径以及分子量信息。动态光散射仪可以同步实时提供样品粒子尺度以及分布状态信息。这些信息与收集到的生物大分子散射信号相互验证,保证了SAXS检测体系的均一性。装置的整体布局参见图4-19。
4.Linkam冷热台样品装置
针对有实验温度变化测试需求的SAXS用户,BL19U2生物小角X射线散射实验站还配备了Linkam HFSX350型号的冷热台。原位冷热台的关键组件——热台,由银质加热块、测温元件以及密闭腔室组成。固体样品可直接紧固,放置于高度抛光的银质加热元件上。液体样品可注入外径小于1.7 mm的石英毛细管中,将其从侧面插入热台加热块通孔内,而不需要打开上盖。银质加热元件保证了极佳的热传递和温度测量。精度高于0.1℃的铂电阻传感器提供了非常精确和稳定的温度信号。该设备的主要特点为变温范围宽广,可以在-196~350℃之间以最快30℃/min的加热或冷却速率变温。其具体设备组成,见图4-20。
图4-19 BL19U2生物小角X射线散射线站的SEC-SAXS溶液样品装置(彩图见图版第10页)
HPLC:高效液相色谱(high performance liquid chromatography);DLS:动态光散射(dynamic light scattering);X-ray:X射线。
图4-20 BL19U2生物小角X射线散射线站的Linkam热台样品装置
5.停流-混流时间分辨样品装置
时间分辨小角X射线散射(time-resolved SAXS,TR-SAXS)技术,由于具有时间分辨特性,可以提供生物大分子以及超大分子复合物动态反应过程的瞬态中间体结构信息,对于阐明重要生物大分子的折叠机理,以及针对特定生物大分子活性结构的药物设计,具有重要意义[18]。BL19U2生物小角X散射实验站配备的时间分辨样本装置,依托法国比奥-罗杰(Bio-Logic)公司生产的型号为SFM2000的快速动力学停流混流(stop-flow)装置而进行自主设计改造,通过高压氮气(N 2)将分装在2个注射器中的2种反应溶液,经管道快速驱动至混合室,迅速混合而相互反应,然后迅速停止混合液在样品室中的流动,进而通过高强度的X射线来记录反应体系的散射强度变化,以阐释反应体系的动力学过程。机械部分由样品室、样品室支架、温控系统以及进样监控系统等主要部件组成。时间分辨样品装置的主要部件如图4-21所示。
图4-21 BL19U2生物小角X射线散射线站的时间分辨样品装置(彩图见图版第10页)
该时间分辨样品装置可以混合2种以上的溶液样品。实验过程中的混流间隔时间小于20 ms,样品混合比例可以在1﹕1~1﹕100之间,依据用户的测试需求设计。实验所需最少样品用量为100μl,测试温度在4~80℃之间可调。
4.1.5.6 精密可调狭缝
BL19U2生物小角X射线散射线站实验站的精密可调狭缝系统,采用了丹麦JJ X Ray公司生产的型号为IB-C30-HV的Kratky狭缝。在靠近样品装置的位置所设置的最后一道狭缝,采用了型号为ACM-C8-1SL01-C的Xenocs无散射狭缝,用于滤除来自前端所有光学元件的不必要杂散射。整套狭缝系统除狭缝外,还包括散射附件、样品和探测器垂直运动平台等设备。狭缝移动的步距分辨率为1μm,重复精度为±1μm,运行精度为±2μm。几道狭缝相互作用,协同负责光束的优化,滤除冗余的杂散光。
4.1.5.7 控制和数据采集系统
控制和数据采集系统的设计框图,如图4-22所示。
图4-22 BL19U2生物小角X射线散射线站实验站的控制和数据采集示意图
BL19U2线站的整个系统,由EPICS系统控制和进行数据采集,用户界面为EPICS界面。通过以太网,利用一台PC机来控制现场设备。用户操作界面单独使用一台PC机。电机控制系统主要由电机、电机驱动器、电机控制器和CPU卡组成,其中电机驱动器选择SLS驱动器,电机控制器选择MAXv8000,CPU卡选择MVME5500。光强检测系统主要由RIGI光强位置监测器/光电管、放大器、V/F转换器和计数器组成。测量精度达到0.1%,能够准确反映1 mg/ml的浓度变化。其中用于光强测量的光强及位置监测器,接收面积大于4 mm×2 mm,探测光子的能量范围为7~15 keV,能够响应1012 phs/s量级的光子通量,准确测量光强波动为0.1%的光强变化。光电管的响应在7~15 keV的线性区,能够测量光强0.1%的变化。集成在挡光元件上的光电管,能够响应109 phs/s的变化。低噪声电流放大器,具有109倍以上的多级放大能力,输出误差<0.01%。NIM插件V/F转换器可选型号为1 MHz/10V、1 MHz/1V、1 MHz/100 mV、1 MHz/10 mV,输入误差<0.01%,输出误差<0.02%/FS。NIM插件计数器的输入电压为3.3或5 V(TTL信号)[8],可连续计数时间>1 h,可与计算机通信(RJ45或RS232)。NIM插件的多路高精度同步触控制器的输入/输出电压为3.3或5 V(TTL信号),同相4路同步触发输出,反相4路同步触发输出,同步误差<10 ms。控制设备还配备有标准NIM机箱。用户操作界面参见图4-23。
4.1.5.8 数据分析、储存系统
BL19U2生物小角X射线散射实验站还配备有完善的软件库,包括光束线各元件的控制程序、小角散射实验站各系统控制程序,还有常规小角散射数据获取程序以及数据处理程序等。针对实验结果数据分析处理的关键步骤,线站为用户提供了多种主流BioSAXS数据分析软件,供用户根据使用习惯进行选择。其中由美国康奈尔BioSAXS同步辐射线站开发的Bio XTAS RAW程序[19],主要用于对2D散射图像批量进行强度积分,获得1D散射曲线(见图4-24)。
图4-23 BL19U2生物小角X射线散射线站实验站样品装置的操作控制界面示意图(详见下载图4-23,下载网址见31页脚注)
图4-24 BL19U2生物小角X射线散射线站实验站的散射数据分析程序BioXTAS RAW(详见下载图4-24,下载网址见31页脚注)
BL19U2线站还安装了由欧洲分子生物学中心汉堡分站(EMBL-Hamburg)BioSAXS课题组开发的基于ATSAS[2024]小角散射数据分析软件包的自动数据分析处理安装文件。这样,溶液用户可以在线站收集数据的现场,获取测试样品的即时结构参数与形貌信息,更好地判断测试样品的性状,指导现场数据收集。软件图例参见图4-25。
图4-25 BL19U2生物小角X射线散射线站实验站的散射数据分析程序ATSAS pipeline(详见下载图4-25,下载网址见31页脚注)
4.1.5.9 棚屋、辐射防护和安全联锁系统
BL19U2生物小角X射线散射实验站棚屋,为同步辐射散射实验测量场所,由光学棚屋和实验棚屋组成。光学棚屋设置在光束线的前端,与隧道外侧锯齿墙直接相连。实验棚屋位于尾部,用于线站开展科学实验。棚屋的墙板由框架性焊接槽钢与钢铅夹芯板焊接构成。夹芯板由6 mm厚的内层钢板、铅板和4 mm厚的外层钢板焊接构成。墙板骨架采用8#槽钢,规格尺寸为80 cm×43 cm×5 cm。槽钢固件与内层钢板焊接,之后用膨胀螺栓固定在地面上。棚屋的标准顶盖也是由框架性焊接槽钢与钢铅夹芯板焊接构成。顶盖骨架采用10#槽钢,规格尺寸为160 cm×65 cm×8.5 cm。
线站配备有人身安全连锁系统。该系统由光束线站棚屋、安全光闸、光子光闸、启动控制装置、电控锁、带有声光报警器的搜索逻辑电路箱、棚屋门位置传感器以及带有操作面板及状态显示、搜索/复位按钮和紧急状态下切断同步辐射束流(踢束)按钮等部位的主控机柜所组成。线站人身安全连锁系统采用可编程控制器(PLC)程序控制。PLC采用美国Allen-Bradley公司的Control Logix PLC,输入输出控制板(I/O controller,IOC)选用Versa总线模块欧式卡(Versa Modular Eurocard bus,VME)的CPU模块MVME5500,IOC和PLC之间的通信通过以太网工业协议(Ethernet/IP)实现。整个系统可在EPICS软件环境下运行。IOC负责按照预定的安全控制逻辑执行,确保安全光闸、光子光闸、防护门等的安全操作,保证实验人员不受辐射伤害。
线站运行时,禁止人员进出光学棚屋。线站运行时必须在关闭光闸(SS2或SS1以及PS2)之后才能开门。只有在关门钮中的绿灯亮后按下才能关门。门关到位后绿灯熄灭。
4.1.6 生物X射线小角散射光束线的测试指标
根据光束线建设目标所规定的光束线参数,在建设完成后对BL19U2生物小角X射线散射光束线,进行了相关的测试与标定。
4.1.6.1 双晶单色器光子能量范围的标定
根据布拉格衍射公式2d sinθ=λ可知,晶体对入射波的衍射,取决于晶体的结构以及入射波的波长。其中d表示晶体的面间距;θ表示布拉格角。对于Si(111)晶体,d=0.313 5 nm。由于商业化DCM[9]存在晶体晶格常数变化、入射光与衍射面平行度差等问题,因此常采用金属元素的吸收边,来标定单色器测量角度与单色光能量的关系。考虑到Cu的K边吸收存在一个独立的窄吸收峰,用于能量定标比较合适。Cu的K吸收边上的小峰应该位于8 981.3 e V处。经过校正后的Cu吸收边如图4-26所示。
图4-26 采用Cu吸收边标定BL19U2光束线的能量调节范围
为在实验上验证光子能量的范围,分别测量了金属Fe和Pb的吸收边。根据K边和L2边跃迁,两者的能量分别为7.112 keV和15.200 keV。测试结果参见图4-27。根据测试结果,布拉格转角的重复精度在15 keV下的误差,对于能量调节范围的影响不会超过2 eV。
图4-27 在BL19U2光束线的能量调节范围测定Fe和Pb吸收边的测量结果
4.1.6.2 双晶单色器能量分辨率的标定
光束线的能量分辨率的测定原理及方法,可参考第3章相关内容(110页“3.7.1.2 能量分辨率”)。BL19U2生物小角X射线散射光束线在12 keV能量下的双晶单色器能量分辨率的摇摆曲线测试结果如图4-28所示。数据拟合使用Origin软件。根据软件中高斯函数的定义,摇摆曲线半高宽(FWHM)为0.001 88,计算结果为△E/E=1.96×10-4。
图4-28 BL19U2生物小角X射线散射线站实验站的双晶单色器能量分辨率测试结果@12 keV
4.1.6.3 聚焦光斑尺寸的测定
光斑尺寸测量,采用精密四刀狭缝和电离室测量。狭缝为IBC30HV(JJ X-Ray公司)的电动狭缝,刀片移动精度小于1μm。将狭缝放置于光束焦点位置,以一定的步长移动刀片和打开狭缝,每移动一步记录一次计数器的值。每次测量得到一个沿刀片移动方向的光强积分值,对这些数据求微分就得到光强的分布。测试结果如图4-29、图4-30所示。探测器前的聚焦光斑在水平方向上的尺寸为328μm,在垂直方向上的尺寸为48μm。
图4-29 BL19U2生物小角X射线散射线站实验站的聚焦光斑水平尺寸的测试结果
图4-30 BL19U2生物小角X射线散射线站实验站的聚焦光斑垂直尺寸的测试结果
4.1.6.4 光子通量的测定
光子通量的测量使用电离室-皮安计测量系统。在入射X射线光子中,穿过电离室未参加电离的光子数比例为e-μx,可以计算出实际参加电离的光子数N i,具体计算公式如下:
N为入射光子总数。电离电流强度I 0可以表示为:
将4-9式代入4-8式得到入射光子总数的计算式
式中f为实测频率;B为频率与电压转换常数。测量时使用的设备参数为100 k Hz/1 V;G为V/I信号增益;μ为气体的X射线线性吸收系数;e为电子电荷常数1.6×10-19 C(库仑);ε0为气体的平均电离能,其中N2为36 eV,空气为34.4 eV;E为X射线光电子能量(eV);x为电离室长度。对12 keV能量而言,140 mm空气的吸收为1-e-μx=0.044(根据XOP[10]计算得到)。束流强度为240 mA。电离室内充空气。测试结果如图4-31所示。
图4-31 BL19U2生物小角X射线散射线站实验站的光子通量测试拷屏结果(详见下载图4-31,下载网址见31页脚注)
实际测试的结果表明,BL19U2线站在焦点处的电离室计数为7.5×10-6@240 m A。考虑从样品处到聚焦焦点途中所经的空气段,以及Kapton膜吸收的影响,推导出样品处电离室计数8.8×10-6 A@240 m A,计算得到300 m A时样品处光子通量为4.47×1012 phs/s@12 keV@300 m A。
4.1.6.5 光束发散角的测定
图4-32 BL19U2生物小角X射线散射线站实验站狭缝6处光斑的水平尺寸的测试结果
图4-33 BL19U2生物小角X射线散射线站实验站狭缝6处光斑的垂直尺寸的测试结果
通过扫描狭缝5和狭缝6,得到这2个狭缝处光斑的水平和垂直尺寸。根据焦点处光斑的水平和垂直尺寸以及狭缝距离焦点的长度,得到光束的水平和垂直发散角。测试结果如图4-32、图4-33所示。根据测试的结果推算,焦点处光斑的水平尺寸为337μm,垂直尺寸为45μm;在狭缝6处光斑的水平尺寸为397μm,垂直尺寸为192μm。因狭缝5距离聚焦点8 m,所以得到:焦点处的水平发散角为8μrad,垂直发散角为18μrad。
4.1.7 生物X射线小角散射线站的用户成果
作为国内首条生物溶液样本的小角X射线散射研究的技术平台,BL19U2线站在国内的结构生物学领域占据重要的主导地位。该线站具有光子通量高、光束发散角度低的特点。自2015年3月份正式对用户开放试运行以来,它已累计提供有效机时逾8 000 h,涉及50多家单位,累计接待课题组100余个。该平台的运行对于我国自主建立和整合生物X射线小角散射技术、蛋白质晶体学技术、核磁共振技术、冷冻电镜(cryo-EM)技术以及计算生物学的蛋白质结构与动力学研究平台,具有关键意义。该平台的顺利运行,拓宽了同步辐射光源在生物学领域,尤其在生物大分子结构生物学研究领域的应用范围。下面简述依托BL19U2生物小角X射线散射线站而发表的典型用户成果。
4.1.7.1 同步辐射生物X射线小角散射在生物大分子复合物结构生物学领域的应用研究
2016年5月25日,国家蛋白质科学研究(上海)设施BioSAXS线站用户华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的殷平教授带领其课题组成员,在国际权威学术期刊《自然》(Nature)上发表了对N6腺嘌呤甲基转移酶METTL3-METTL14蛋白质复合物晶体结构的最新研究进展。RNA N6腺嘌呤甲基化修饰在病毒、细菌、酵母、拟南芥、水稻以及人类中普遍存在,且修饰过程非常保守。殷平课题组利用上海设施的复合物晶体结构线站(BL19U1)、X射线小角散射线站(BL19U2),首次解析了与RNA N6腺嘌呤甲基化修饰功能有密切相关的甲基转移酶复合物核心成员METTL3-METTL14蛋白质复合物的晶体结构(参见图4-34)。研究表明,METTL3和METTL14这2个甲基转移酶,在复合物中存在着功能分化。METTL3主要起催化作用,而METTL14主要提供结合底物的平台。该研究为全面了解在生物生长发育过程中调控开关RNA N6腺嘌呤的甲基化修饰,奠定了基础[25]。
图4-34 N6腺嘌呤甲基转移酶METTL3-METTL14蛋白质复合物晶体结构的SAXS研究(详见下载图4-34,下载网址见31页脚注)
研究者基于已解析的N6腺嘌呤甲基转移酶METTL3-METTL14蛋白质复合物晶体结构,采用小角X射线散射的方法,验证了溶液状态下该复合物在无配体添加(ligand-free)与添加Ado Met、Ado Hcy(Adomet-bound、Ado Hcy-bound)2种配体的条件下活性结构的稳定性。Ado Met:S 腺苷甲硫氨酸;Ado Hcy:S-腺苷同型半胱氨酸;Gate loop:门控环。(图片引自[25])
4.1.7.2 同步辐射生物X射线小角散射在生物合成化学领域的应用研究
2016年10月,英国皇家化学会的《化学科学》(Chemical Science)杂志以封面形式报道了中国国家蛋白质科学研究(上海)设施BioSAXS线站用户在荧光分子探针构建与应用方面的研究进展。该工作由中科院药物研究所李佳、藏奕课题组与华东理工大学贺小鹏课题组合作完成。他们共同开发了一支可用于同时检测超分子交联蛋白的新型糖基折叠型探针。这种探针采用2种常用的荧光染料,促使探针在水相中形成一类“自折叠”的染料折叠体,进而在荧光探针部分引入可被花生凝集素(peanut agglatinin,PNA)与脱唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGRr)识别的半乳糖。通过应用SAXS技术,证实了这一折叠体可通过与PNA的相互作用而解折叠,进而通过芘分子间的堆叠作用,形成探针/凝集素超分子交联体(参见图4-35)。这一发现可用于检测并协同调控生物大分子的结构,对于流行性病毒的快速检测具有重要意义[26]。
图4-35 糖基折叠探针结构及蛋白质作用模式的SAXS研究(详见下载图4-35,下载网址见31页脚注)
研究者采用已知的花生凝集素单体的晶体结构,基于SAXS散射数据构建了分子模型。将晶体结构与SAXS模型进行拟合,由此可解释花生凝集素与脱唾液酸糖蛋白受体相互识别的作用机制,为流行性病毒的快速检测提供了数据支持。1Å=0.1 nm。(图片引自[26])
4.1.7.3 同步辐射生物X射线小角散射与NMR联用解决生物学问题的应用研究
“生命在于运动”是法国著名思想家伏尔泰(Voltaire)提出的运动哲学格言。蛋白质作为生命组成的基本单元,其本身也是处于不断运动的动态过程中。作为生命活动的执行者,蛋白质只有通过运动才能执行特定的生物学功能。为了更好地了解蛋白质结构的动态变化过程,中科院武汉物理与数学研究所的唐淳率领其科研团队,发展了一种免标记的顺磁核磁技术,不仅能够在接近生理环境的溶液状态下对蛋白质的动态结构进行解析,还避免了传统顺磁核磁技术的局限性。2016年12月19日,唐淳课题组的研究人员用这种新方法准确捕获了不同大小、不同运动特性的蛋白质体系在溶液中的动态系综结构,并借助上海设施的BioSAXS线站,对数据进行了验证(参见图4-36)。相关研究成果发表在《德国应用化学杂志》(Angewandte Chemie International Edition)。该研究借助SAXS技术,完美验证了课题组开发的顺磁核磁共振技术对蛋白质系综结构分布的标记,也进一步说明了SAXS与核磁两者的整合研究,将在其他领域发挥越来越重要的作用[27]。
图4-36 用SAXS技术与溶液顺磁弛豫增强技术研究蛋白质动态结构的应用实例(详见下载图4-36,下载网址见31页脚注)
paramagnetic consolute:顺磁探针;intensity:散射强度;a.u.:表示相对强度,无单位;observed:实验数据;ensemble:整体拟合;open:延展结构;ATP closed:在ATP作用下的闭合结构。(图片引自[27])
研究者充分利用了以小角X射线散射技术与核磁共振技术在溶液中开展测试的技术特点,基于生物大分子在溶液中动态构象变化的系综平均小角X射线散射曲线,通过自主开发的顺磁核磁共振技术,对蛋白质系综结构的分布进行标记,完成了对生物大分子动态结构的解析。2种技术的有机结合,有效避免了传统的顺磁核磁技术需要对蛋白质本身进行修饰标记的限制,具有非常重要的应用意义。
4.1.7.4 基于同步辐射生物X射线小角散射技术的生物被膜形成机制研究
细菌生物被膜是菌体为适应环境,黏附于物体或者人体组织表面,通过分泌大量的多糖、蛋白质和核酸等胞外基质,将自身包裹在其中而形成的聚集膜样物。生物被膜与人类的健康和疾病紧密相关,比如导致牙菌斑的形成以及跟植入式医疗器械相关的感染。相比于单个的浮游细菌,生物被膜的形成会对抗生素和宿主免疫系统产生更强的抵抗,使感染慢性化和反复化,导致严重的临床问题。因此,生物被膜的形成机理一直是国内外学者研究的重点领域。2017年11月10日,国际知名期刊e Life杂志在线发表了上海交通大学医学院附属瑞金医院、上海市血液学研究所、医学基因组学国家重点实验室蒙国宇团队的最新生物被膜研究论文。该文报道了沙门氏菌非典型菌毛Saf介导生物被膜形成的机制。在e Life的报道中,蒙国宇课题组通过结构生物学表征手段,获得单个Saf D以及3个连续亚基Saf DAA的高分辨率蛋白质结构,并进一步利用SAXS以及细胞功能实验,多角度印证了文中提出的Saf介导生物被膜形成的模型[28](参见图4-37)。
图4-37 用SAXS技术研究Saf介导生物被膜的形成机制(彩图见图版第11页)
图片引自[28]。
研究者基于实验室自主解析的单个Saf D以及3个连续亚基Saf DAA高分辨率蛋白质结构,利用溶液小角X射线散射技术,有效表征了细菌生物被膜组装过程中的不同聚合状态组分,并进一步通过细胞功能实验,多角度印证了Saf介导生物被膜形成的模型。
总而言之,随着同步辐射光源和SAXS数据处理方法的发展和改进,通过SAXS检测技术与其他高分辨率结构生物学检测技术[例如晶体X射线衍射(macromolecule crystallograph,MX)、核磁共振(NMR)以及低温冷冻电镜(cryo-electron microscopy,cryo-EM)等]的有效结合,SAXS作为一种新兴的结构生物学研究手段,将在结构生物学领域,特别是在多结构域蛋白质和超大复合物的溶液结构以及功能调节研究中,发挥更大的作用。
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